이 작품은 NIH 보조금 DP2OD008470에 의해 부분적으로 지원되었다. 또한, RAM은 노트르담 대학원 대학교에서 제공하는 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 줄기 세포 및 노트르담 대학의 재생 의학을위한 생물 과학학과, Zebrafish의 연구를위한 센터 및 센터의 직원을 감사드립니다. 우리는 특히 신장 생물학,이 작품에 대한 자신의 도움이 피드백에 대한 토론을 결합하기위한 실험실의 구성원을 감사드립니다.

이 프로토콜에 설명 된 제브라 피쉬 배아 작업을위한 절차는 노틀담 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 솔루션 1. 준비 <ol><li> RT에서 73.0 g의 NaCl, 3.15 g의 KCl, 9.15 g의 CaCl2를 증류수 5 L의 9.95 g의 황산 및 저장을 혼합하여 E3 배아 매체 50X 스톡 용액을 만든다. </li><li> 제브라 피쉬 배아의 배양를 들어, 다음 매 1 살균제 역할을 1 배 E3의 L, 및 상점에 0.05 % 메틸렌 블루의 200 μl를 추가, 증류수 1X 작업 솔루션 E3 배아 미디어 주식의 50 배 원액을 희석 RT. </li><li> 0.06 mg을 PTU와 50X E3 재고 40ml를 조합하여 0.003 %, 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU)와 E3 배아 매체 색소 블로킹 용액을 만든다. 증류수 2 L의 총 부피를 가져온다. </li><li> 솔루션에 PTU 분말을 얻을 RT에서 E3 / PTU의 O / N를 저어. 그런 다음에 E3 / PTU를 저장RT. E3 / PTU는 약 1 주일의 수명을 가지고 있으며, 이전 솔루션은 제브라 피쉬 애벌레에 색소 침착 개발을 차단 덜 효과​​적 일 것입니다 있습니다. </li><li> 500㎖의 증류수에 Tricaine 1 g을 첨가하여 0.2 % Tricaine (MS-222)의 마취제 용액을 1 M 트리스, pH가 9.5 7.2 pH를 조정한다. </li><li> Tricaine 4 ℃에서 추가 0.2 %의 1/10 번째 볼륨, 1X E3 (NO 메틸렌 블루)의 용액을 배치하여 촬상하는 2 % 메틸 셀룰로오스 용액을 준비. 주 : 메틸 셀룰로오스 용액을 부드럽게 현미경 살아있는 배아를 안정화하기 위해 사용되는 두꺼운 투명한 용액이다. 조작이 수행 된 후 배아는 동물의 부상과 같은 시편의 후속 단계에서 현미경을 사용하지 않고 메틸 셀룰로오스를 용해 1 배 E3에서 세척 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C로 냉각하면 볶음 접시에 적극적으로 1 배 E3 / Tricaine 솔루션을 저어 점차 메틸의 적절한 금액을 추가셀룰로오스 분말을 격렬히 교반하면서 계속. 점차적 메틸 불용성 응집체의 형성을 방지하기 위해 용액에 분말을 추가한다. </li><li> 모든 분말이 2 % 메틸 셀룰로즈 / E3 / tricaine 용액에 혼합 한 후 39 ° C 냉장실 O / N의 합성 용액을 교반한다. 참고 : 차가운 온도가 완전히 분말을 용해에 가장 적합합니다. 용액을 하룻밤 후에 명확하지 않으면, 추가적인 업무 시간 및 / 또는 제 O / N 동안 교반한다. </li><li> 30 분 또는 2 시간까지 4 ° C에서 고속 (12,000 XG)에서 1.5 ml의 튜브와 스핀에 2 % 메틸 셀룰로오스 / E3 / tricaine 솔루션 나누어지는 혼합물로부터 기포를 제거합니다. </li><li> 장기간 저장을 4 ℃에서 2 % 메틸 셀룰로즈 / E3 / Tricaine 용액을 놓는다. 참고 : 이전에 사용에 분취 량은 제브라 피쉬 표본 작업을위한 RT에 미리 예열해야합니다. </li></ol> 도구 2. 준비 <ol><li> 포에 사용되는 배아의 조작 도구를 준비5 &quot;직선 해부 바늘의 끝 부분에 젤 로딩 팁을 부착하여, 미세 주입을 위해 배아를 sitioning, 테이프 나 순간 접착제로 고정합니다. </li><li> 먼저 불을 배치하여 바늘 풀러를 사용하여 미세 주사 바늘을 준비 악기에 필라멘트와 10cm의 붕규산 유리를 연마 핸들을 조여 붕규산 유리를 고정합니다. </li><li> 미세 테이퍼 바늘을 패션 할 붕규산 유리를 잡아 당깁니다. 다음 설정을 사용 : (540)를 가열, (245), 속도 (200), 시간 (125)를 잡아 당깁니다. </li><li> 모델링 점토의 스트립을 중단 페트리 접시 안에 장소 바늘, 바늘 끝을 보호하고 먼지 축적을 방지하기 위해 덮여 접시를 유지합니다. </li><li> microinjections 용 바늘을 준비 완료하려면 약 0.05-0.1 mm의 직경을 가진 예리한 각도 분사구를 만들 바늘의 인출 단부를 절단하는 면도날 에지 또는 미세 핀셋을 사용한다. </li><li> 마이크로 인젝션 트레이를 확인하기 위해, 10에서 1.5 % 아가 로스 / E3 용액을 조제0 ㎖의 삼각 플라스크 후 약 10 분 동안 실온에서 냉각 할 수 있도록 전자 레인지에 종기에 E3를 가열하여 아가 로스를 녹인다. </li><li> 약 0.5 cm의 깊이 기반을 만드는 페트리 접시로 냉각 아가 / E3 용액을 붓는다. 이 약 0.3 cm의 깊이와 제 2 층을 부어과 조립식 배아 잘 금형을 삽입하고 아가로 오스 실온에서 고화 할 수 응고합니다. 주 : 기포의 수를 감소시키는 각도로 아가로 주형을 두는 상단 한천 / E3 층에 몰드를 삽입 할 때. </li><li> 전체 미세 주입 트레이가 설정되면, 조립식 배아 그럼 4 ° C에서 E3 솔루션 및 저장과 접시를 작성, 천천히 그리고 신중하게 scoopula를 사용하여 성형 올립니다. </li></ol> 3. 배아 준비 <ol><li> 상대 챔버에 칸막이를 배치하여 제브라 피쉬 상대 탱크를 설정하고 시스템 물을 채우십시오. </li><li> 디바이더 (S)의 각 측면에 하나의 물고기를 배치UCH는 각 결합 챔버는 한 여성과 한 남성 물고기를 포함하고, 각각의 결합 챔버를 포함하는 것이. </li><li> 다음날 아침, 산란을 사용할 수 있도록 칸막이를 제거합니다. </li><li> 후 약 30 분, 그리고 수족관에 성인을 반환 한 후, 미세 와이어 메쉬 스트레이너 도구를 통해 상대 탱크의 물을 통과하여 태아를 수집 물고기를 확인합니다. </li><li> 페트리 접시 위에 스트레이너를 반전하고 배아를 수집 E3 씻어. </li><li> 28.5 ° CO / N에서 배아를 품어. </li><li> 배아는 24 ~ 26 체절 단계 (26)에 도달하면, 배아의 각 접시에 50 ㎎ / ㎖ 프로 나제의 100 μl를 추가하고 약 15 RT의 요리 (23 ° C)를 배양하여 dechorionate 다음 E3 미디어의 대부분을 가만히 따르다 분. 참고 :이 방법 설명 및 28.5 ° C에서 O / N을 배양 수집하는 경우 배아가 24 ~ 26 체절 단계에 도달하는 것은 수정의 시간에서 약 24 ~ 25 시간이 소요됩니다. </li><li> 와 접시를 채우다음 E3 및 배아에서 chorions을 제거하기 위해 부드럽게 소용돌이 친다. </li><li> E3 / 프로 나제​​를 가만히 따르다와 신선한 E3 25 ㎖로 접시를 씻어. 반복 세정 단계는 모든 프로 나제​​를 제거합니다. </li><li> 색소 침착의 개발을 차단하려면 E3를 가만히 따르다 및 배아가 24 시간 게시물 수정에 도달 한 신선한 E3 / PTU 25 ㎖로 교체하십시오. 참고 : 실험은 며칠에 걸친를 들어, 깨끗한 접시를 유지하기 위해 하루에 한 번씩 신선한 미디어와 함께 E3 / PTU 솔루션을 교체합니다. </li></ol> 콩팥 세포 독소 솔루션 4. 미세 주입 <ol><li> 주사 당일, 해당 차량 제어와 함께 원하는 콩팥 세포 독소 용액을 제조 하였다. </li><li> 소용돌이 또는 약물 (들)을 보장하기 위해 부드럽게 섞어 물 컬럼의 튜브 톱의 측면을 검사 / 솔루션에 있습니다. 주 : 콩팥 세포 독소 용액은 미세 주입 효율을 감시하고 또한 subseq에서 신장 클리어런스를 평가하기 위해 형광 접합 된 덱스 트란 미량 포함하도록 제조 될 수있다uent 시간은 20,28 포인트. </li><li> 바늘의 뒷면에 미세한 젤 로딩 팁을 스레딩에 의해 콩팥 세포 독소의 ~ 2-3 μL와 트림 미세 주사 바늘을 넣고 용액이 중력에 의해 트리밍 바늘 끝을 채울 수 있도록 테이프의 조각 수직으로 바늘을 일시 중지합니다. </li><li> 바늘 끝이 가득되면, 미세 조작기에로드 된 바늘을 고정합니다. </li><li> 마이크로 미터 슬라이드에 미네랄 오일 방울을 배치하여 미세 주입 부피를 시험하여 액적 크기를 평가하기 위해 오일에 주입. 500 (PL)의 주입량은 0.1 mm의 직경을 갖는다. </li><li> 인큐베이터에서 배아의 접시를 제거하고 배아 접시에 약 0.2 % Tricaine 5 ㎖를 추가하여 마취. </li><li> 전체 마취를 보장하기 위해, 부드럽게 배아 조작 도구의 끝 배아를 터치합니다. 운동 부족은 충분한 마취를 나타냅니다. </li><li> 성공적인 마취 후, TRANSF으로 사출 금형 배아 전송어 피펫. </li><li> 트렁크가 우울증 함께 달려 꼬리가 우울증에서 올라 스틱 것을 잘 등의 깊은 영역에 머리를 배치하는 금형의 다른 우물에 각 배아를 기동. </li><li> 미세 조작기로 채워진 바늘을 삽입하고 배아 옆에 바늘 끝의 위치. </li><li> 부드럽게 전방으로 조이스틱을 움직여서 꼬리기에 바늘을 삽입하고 미세 주입을 전달하기 위해 풋 페달을 누르기. 참고 : 성공적인 주입은 액체를 보면서 계측 할 수있다 순환을 입력합니다. 또한, 형광 접합 된 덱스 트란과 nephrotoxicant의 공동 주입 절차 이후 성공적으로 주사를 확인하기 위해 연구를 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거하기 위해 조이스틱을 뒤로 당기십시오. </li><li> 주입 후, 깨끗한 접시에 배아를 전송하고 Tricaine를 제거하고 신선한 E3 / PTU로 교체하는 린스. </li><li> 엉덩이에 원하는 시점에 배아 부화원하는대로 실험 분석을 위해 메틸 설치 미디어 또는 과정에서 촬영으로 설명 할 수의 형태. 주 : 배아 신장 회복은 일반적으로 상처를 나타낸다 부종, 개인의 비율을 결정하기 위해 평가되어야한다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

치료제의 다양한 수는 AKI (29)과 연관되어있다. 예컨대 아미노 글리코 사이드 겐타 마이신 (30) 및 널리 사용되는 항암제 시스플라틴 31,32 많은 개별 화합물에 의해 유도 된 손상을 이해하는데 상당한 연구가 진행되어왔다. 이러한 조건에 관련된 일부 병리학 적 변화하지만, 지속적인 연구의 대상이 남아있다. 한 긴급 과제는 여러 약물에 악영향 같은 중요한 관리 설정에서 ?...

AKI 충격적 건강 한 결과로 이어질 수있는 신장 기능의 급격한 손실이다. AKI는 더 높은 중요한 치료의 경우 30 % ~ 50 %의 요금과 노인, 그리고 50-70% 1-3의 사망률로 인해 입원 환자 중 약 20 %의 높은 빈도로 세계적으로 중요한 건강 문제입니다. 불행하게도, AKI의 유병률은 증가하고있다 인한 항생제 등 nephrotoxins에 수술 후 스트레스, 허혈, 노출을 포함 AKI을 유도 할 수있는 요인의 다양성에 부분적으로 향후 10 년간 더욱 확대 할 것으로 예상된다 화학 요법 약물 4. AKI 일반적 필수적인 기능 단위이며, 혈액 필터 및 중앙 포집 관 (1)에 소변 배수 세그먼트 세뇨관으로 구성되어 네프론, 발생, 신장 내의 급격한 세포 손상을 포함한다. 경우 네프론의 상당수는AKI 중에 손상, 즉각적인 효과가 죽고 죽어가는 세포 1에서 장애물로 인해 네프론을 통해 순환 폐기물 통관의 중단 및 축소 또는 폐지 유체 유동을 포함한다. 시간이 지남에 관 폐쇄가 영구적으로 신장 기능 1을 줄여 전체 네프론의 퇴보로 이어질 수 있습니다. AKI 다음과 같은 신장의 생리 학적 변화는 만성 흉터 1로 이어질 수 복잡한 염증성 이벤트를 포함한다. 이러한 성과에도 불구하고, 네프론은 관 상피 5,6 재구성 AKI 후 재생을 받아야하는 몇 가지 능력을 가지고있다. 네프론 재생의 증가 분자량이 이해되었지만, 메커니즘은 많은 관해서 애매 남아 조사 7을 계속 필요로한다. AKI는 영구적 인 신장 손상을 초래하는 정도는 알 수없는 남아 있습니다. 현재의 연구는 신장에 대한 회생 가능성이있다 제안가장 높은 더 두드러 또는 반복 에피소드가 만성 신장 질환 (CKD)으로 이어질하면서, AKI 덜 심한 경우는 다음과 생명을 구하는 이식 또는 투석 8,9가 필요 말기 신장 질환 (ESRD) 절정에 달하다. 또한, 이미 CKD으로 고통받는 사람들은 AKI 8,9의 심각한 에피소드를 계약의 더 높은 위험에 노출됩니다. 함께 찍은, 기초 및 임상 연구, 이해하고 치료하고 AKI을 방지하기 위해 매우 중요합니다 계속이 분명하다. 동물 모델 연구 AKI (10) 중에 발생하는 지역 및 환경 변화의 진행을 감상하는 수단이되고있다. 이러한 이해를 확장 할뿐만 아니라, 새로운 치료법을 개발하기 위해, 제브라 피쉬 동물 모델은 가지 (11, 12)의 다양한 사용되어왔다. 제브라 피쉬 신장의 네프론은 배아와 성인 모두에서, 포유류 13 ~ 16과 보존의 높은 수준을 표시합니다. ZE에서 또한, 네프론 상피 부상brafish는 관 세포의 지방 파괴가 관내 증식과 네프론 구조 17-19의 재설정 다음된다 높은 척추 동물에서 프로세스를 닮았다. 배아 그러나, 시스플라틴 같은 nephrotoxins에서 광범위한 세뇨관 손상은 치사 (20, 21)와 연결되어 있습니다. 이에 비해, 제브라 피쉬 성인 AKI를 생존과 신장에 실질적인 재생 능력을 나타낸다. 예를 들어, 아미노 글리코 시드 계 항생제 겐타 마이신에 노출 된 다음, 제브라은 세뇨관 상피 손상을 재생하고 새로운 네프론 단위뿐만 22-24 성장. 이 겐타 마이신에 의한 AKI 연구는 다양한 nephrotoxins에서 신장 손상을 이해하는 귀중한 정보를 제공하고 있지만 효과 손상 (25)의 다른 유형에 대한 반응을 평가하는 중요한 남아있다. 제브라 피쉬 배아 인해 크기, 투명도, 유전 취급 용이성에, 콩팥 세포 독소 연구를위한 많은 장점이 있습니다 &lt;마이크로 인젝션 (20, 21)의 방법은 조사를 위해 분자 (들)을 관리하는 데 사용됩니다 SUP&gt; 25. 네프론은 24 시간 게시물 수정 (HPF)에 의해 형성된 약 48 HPF (26, 27)에 의해 혈액을 필터링하기 시작한다. 따라서, 배아 신장의 신속한 형성 및 함수는 실험적 분석을 용이하게한다. 그러나, 마이크로 인젝션 프로세스 기술적 과제를 가지고 기술 습득에 가파른 학습 곡선이있을 수있다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 microinjections을 수행하고 성공적인 주사의 속도를 향상시키기 위해 문제 해결 팁을 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

신장은 혈류에서 필터링 화학 물질에 노출 해에 민감하다. 이는 신장 기능 및 급성 신장 손상 (AKI)로 알려진 임상 증후군의 개발의 급격한 감소와 관련된 장기 부상으로 이어질 수 있습니다. 약학 제제는 개별적으로 투여 될 때 세균 감염 암 범위 의학적 상황을 치료하는 데 사용하거나 다른 약제와 함께, AKI을 개시 할 수있다. 제브라 피쉬는 인간을 포함한 척추 동물 이상으로 보존된다 네프론 기능 유닛 이루어진 배아 신장 형성으로 유용한 동물 모델 생체 내에서 신장 기능의 화학적 효과를 연구한다. 또한, 피쉬는 AKI의 세포 및 분자 패싯 명료 및 nephroprotective 분자 식별 치료 적 전략을 개발시킬 기회를 제공 유전 화학 스크린을 수행하는데 이용 될 수있다. 여기에, 우리는에 얼마나 미세 주입을 보여제브라 피쉬 배아 콩팥 세포 독소 연구를위한 패러다임으로서 이용 될 수있다.

설정된 미세 주입 스테이션은 실체 현미경, 미세 조작기 및 압력 조절기 (그림 1A)를 포함한다. 분사 플레이트 Transillumination이 절차 (도 1b) 중에 시료를 확인하는 것이 바람직하다. 주사 바늘의 제조 백로드 바늘 끝과 절단 가장자리를 제조 하였다 적절한 붕규산 유리를 당기는 것을 포함한다. 최적으로, 바늘 끝이 절단 과정 동안 (도 1C)와</str...

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

화학 요법으로 항생제에 이르기까지 약물을 포함 nephrotoxins에서 발생하는 신장 손상은, 그 발병 기전 불완전하게 이해 남아 복잡한 질환이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라는 신장 보호 대책의 식별에 적용 할 수있는 이러한 조건의 질병 모델에 사용할 수있는 방법을 보여준다.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K 조회수.  University of Notre Dame.  화학 요법으로 항생제에 이르기까지 약물을 포함 nephrotoxins에서 발생하는 신장 손상은, 그 발병 기전 불완전하게 이해 남아 복잡한 질환이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라는 신장 보호 대책의 식별에 적용 할 수있는 이러한 조건의 질병 모델에 사용할 수있는 방법을 보여준다. 

비디오: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

성인 Zebrafish의를 Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...