Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
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파리시 파스퇴르 연구소의 기술 자원 및 연구 센터(C2RT)의 화학유전체 및 생물학적 스크리닝 플랫폼의 Fabrice Agou와 Alix Boucharlat에게 프로토콜에 대한 유용한 제안, 지원 및 과학적 토론을 위한 BGPB 부서의 모든 구성원, 원고를 비판적으로 읽어준 Simon Legood에게 감사드립니다. 작업은 Carnot 전염병 연구소와 Carnot 미생물 및 건강 연구소의 Global Care Initiatives (15 CARN 0017-01 및 16 CARN 0023-01)의 자금 지원을 받았습니다.

1. 효소 및 기질 준비
<ol><li>효소의 정제
	<ol><li>앞서 설명한 대로 세제 가용화된 막으로부터 Lnt 효소를 생산하고 정제합니다 4,8. 간단히 말해서, 37°C에서 16시간 동안 무수 테트라사이클린(200ng/mL)으로 0.6의 OD600에서 C-말단 스트렙 태그로 Lnt를 암호화하는 lnt-연쇄상 구균 유전자의 발현을 유도합니다.</li>
		<li>4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 상청액을 버린다.</li>
		<li>세포 펠렛을 mL당 100 OD600 유닛으로 완충액 WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 중에 재현탁시킨다.</li>
		<li>10,000 psi에서 프렌치 압력 셀 프레스를 통해 2계대로 세포를 분해한다.</li>
		<li>13,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 끊어지지 않은 세포와 파편을 제거합니다. 상청액을 보관하고 펠릿을 폐기하십시오.</li>
		<li>상청액을 120,000 x g 에서 60분 동안 원심분리하고 막 소포(반투명 갈색 컬러 펠릿)를 수집한다. 상청액을 폐기하십시오.</li>
		<li>막 펠릿의 통합 막 단백질을 완충액 WA의 1%(w/v) n-도데실 β-D-말토사이드(DDM)로 실온(RT)에서 30분 동안 가용화합니다. 원심분리하고 불용화된 물질을 120,000 x g 에서 30분 동안 제거합니다. 정제를 위해 상청액 분획을 사용하십시오.</li>
		<li>Nozeret et al.8에 설명된 대로 친화성 크로마토그래피 컬럼(재료 표 참조) 및 S400 겔 여과 컬럼(재료 표 참조)에서 Lnt-연쇄상 구균을 정제합니다.</li>
		<li>정제된 효소를 -80°C에서 0.05% DDM 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액 WA에 저장한다. 알림: 효소는 5 년 이상 안정적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>알킨-인지질 및 비오티닐화 섬유아세포 자극 리간드(FSL-1-비오틴) 기질의 제조
	<ol><li>100 μL의 맞춤 합성 알킨-POPE (1- 헥사 덱 -15- 이노일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 재료 표 참조)를 클로로포름에 1.5mL 튜브에 가용화했습니다.</li>
		<li>주사기로 튜브를 관통하고 RT에서 2 시간 동안 속도 진공에서 클로로포름을 증발시킵니다. 건조 인지질 샘플을 -20°C에서 보관한다.</li>
		<li>사용하기 전에 500 μM에서 0.1% 트리톤 X-100에 알킨-POPE를 용해시킵니다. 필요한 경우 알킨-POPE를 가용화하기 위해 RT의 초음파 수조에서 3분 초음파 처리 단계를 추가합니다.</li>
		<li>FSL-1-비오틴을 445μM의 물에 재현탁합니다. 알림: 두 용액 모두 -20°C에서 최소 2개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 튜브 분석
참고: 1일째에 Lnt 반응을 1.5mL 튜브에 설정하고(2.1단계) 96웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(2.2단계).
<ol><li>시약 혼합물의 제조 및 효소 반응
	<ol><li>표준 Lnt 분석의 경우, Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100)에 알킨-POPE (50 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (445 μM 스톡으로부터 50 μM의 최종 농도)을 1.5 mL 튜브에서 18 μL의 최종 부피로 혼합한다. 모든 조건을 세 번 수행하십시오.</li>
		<li>기질 혼합물 (단계 2.1.1에서 제조)을 초음파 수조에서 3 분 동안 초음파 처리하고 Lnt 효소 (단계 2.1.3)를 첨가하기 전에 37 °C에서 5 분 동안 배양한다. 참고: 티올 특이적 시약인 MTSES(나트륨(2-설포나토에틸)메탄티오설포네이트)는 Lnt8을 억제합니다. 음성 대조군 샘플로 사용할 반응 튜브(단계 2.1.1)에 10mM MTSE(100% DMSO 중 100mM 스톡 용액)를 추가합니다. 총 부피가 18 μL가 되도록 Lnt 반응 완충액의 부피를 조정합니다.</li>
		<li>활성(1ng/μL, 17.2nM에 해당) 또는 비활성 Lnt(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 버퍼 WA에 10ng/μL 스톡 2μL)를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 기질과 혼합합니다(단계 2.1.2).</li>
		<li>반응물을 가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 16시간 동안 37°C에서 인큐베이션합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>96웰 플레이트의 스트렙타비딘 코팅
	<ol><li>H2O에서 2 mg / mL의 스트렙 타비딘 저장 용액을 준비하십시오. 알림: 이 용액은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>스톡 용액에서 작업 용액으로 물에 10μg/mL 스트렙타비딘을 준비합니다. 100 μL의 용액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 인큐베이션하여 플레이트에 결합시켜 웰을 공기 건조시켰다.</li>
	</ol></li>
</ol>참고: 2일째에 클릭 화학(2.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(2.4단계) 형광을 검출하고 결과를 분석합니다(단계 2.5).
<ol start="3"><li>클릭-화학 반응
	<ol><li>아지도-FAM (DMSO 중 5 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; 물에서 제조된 50 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 2 mM 중 tert-부탄올:DMSO (4:1)), 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된50mM)의 원액을 준비한다.</li>
		<li>단계 2.1.4에서 제조된 Lnt 반응 혼합물을 포함하는 1.5 mL 튜브에, 다음 순서로 시약을 첨가하여 클릭 화학을 수행한다: 0.2 μL 스톡 아지도-FAM (최종 농도 50 μM), 0.4 μL 스톡 TCEP (최종 농도 1 mM), 0.2 μL 스톡 TBTA (최종 농도 0.02 mM).</li>
		<li>용액을 5 초 동안 소용돌이. 이어서 0.4 μL의 스톡CuSO4 (최종 농도 1 mM)를 첨가한다. 5 초 동안 다시 소용돌이. 샘플을 RT의 어둠 속에서 1 시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합
	<ol><li>2.2.2 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 200 μL의 PBS-T1(0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 3x 세척한다. 알림: 스트렙타비딘 플레이트는 즉시 사용하거나 4°C에서 건조한 상태로 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>단계 2.3.3의 클릭 화학 혼합물에서 18μL를 96웰 스트렙타비딘 코팅 플레이트의 웰로 옮기고 100μL의 PBS-T1을 추가하여 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킵니다.</li>
		<li>비오틴-플루오레세인(DMSO의 3.1mM 스톡에서 0.26μM)을 스트렙타비딘 결합 및 형광 판독을 위한 양성 대조군으로 사용합니다.</li>
		<li>플레이트를 RT에서 열혼합기의 어둠 속에서 1시간 동안 배양하고 300rpm으로 흔들어줍니다.</li>
		<li>다음과 같이 다채널 전동 피펫으로 96웰 플레이트의 수동 세척 단계를 수행합니다: 200μL의 PBS-T2(1% Tween-20을 포함하는 PBS)로 6회 세척, 피펫으로 3회 세척, 200μL의 PBS로 3회 세척, 피펫으로 3회 세척.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 검출 및 분석
	<ol><li>200 μL의 PBS를 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더에서 520 nm에서의 형광을 기록하였다. 스프레드시트 소프트웨어에 결과를 저장합니다. 참고: 비오틴-플루오레세인은 520nm에서 스트렙타비딘 결합 및 형광 검출을 위한 양성 대조군으로 사용됩니다. 0.26 μM 비오틴-플루오레세인으로 30,000–40,000 AU의 재현 가능한 판독값이 예상됩니다. 모든 샘플은 대조군을 포함하여 삼중으로 분석됩니다.</li>
		<li>각 반응에 대한 표준 편차를 계산하고 통계 소프트웨어를 사용하여 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 음성 대조군과 양성 표본에 대한 P-값을 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 멀티웰 플레이트 분석
참고: 1일째에 384웰 플레이트(단계 3.1)에서 Lnt 반응을 설정하고 384웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(단계 3.2).
<ol><li>시약 혼합물의 제조 및 효소 반응 참고: 시약과 효소의 양은 튜브 분석에 비해 감소하고 Lnt 반응은 384웰 플레이트에서 직접 수행됩니다. 이를 통해 재료를 덜 사용하고 추가로 자동화 할 수있는 단계를 줄일 수 있습니다.<ol><li>기질을 다음과 같이 혼합한다: Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100) 중 알킨-POPE (500 μM 스톡으로부터 최종 농도 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (500 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 384 웰 플레이트 형식으로 웰당 반응당 13.5 μL의 부피로. 모든 조건을 세 번 수행하십시오. 수행할 반응 수에 필요한 시약의 총량을 계산합니다(즉, 384웰 플레이트 1개에 대해 5,184μL).</li>
		<li>초음파 수조에서 3 분 동안 기질 혼합물을 초음파 처리하십시오.</li>
		<li>384 웰 플레이트에서 웰당 기질 혼합물의 13.5 μL를 분취한다. 참고: 음성 대조군으로 웰당 10mM의 MTSES(100% DMSO 중 625mM 스톡 용액)를 추가할 수 있습니다. Lnt 완충액의 부피(단계 3.1.1)를 조정하여 최종 반응 부피 13.5μL에 도달합니다.</li>
		<li>Lnt 효소를 첨가하기 전에 37°C에서 5분 동안 배양한다(단계 3.1.5).</li>
		<li>Lnt 반응 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA)에 0.5ng/μL(8.6nM에 해당) 활성 Lnt 효소 또는 불활성 변이체(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 완충액 WA의 5ng/μL 재고에서 1.5μL)를 단계 3.1.3의 반응 혼합물을 포함하는 각 웰에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 시약을 혼합합니다. 총 반응 부피는 15 μL이다.</li>
		<li>멀티웰 플레이트용 플라스틱 호일로 플레이트를 밀봉합니다.</li>
		<li>가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 37°C에서 16시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스트렙타비딘 코팅 384웰 플레이트<ol><li>2.2.2단계의 스트렙타비딘 75μL(H2O중 10μg/mL)를 사용하여 384웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 배양하여 플레이트에 결합시켜 웰을 자연 건조시킨다.</li>
	</ol></li>
</ol>참고: 2일째에 클릭 화학(3.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(3.4단계), 형광을 감지하고 결과를 분석합니다(단계 3.5).
<ol start="3"><li>클릭-화학 반응<ol><li>아지도-FAM (DMSO 중 1.2 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; H2O에서 제조된 24 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 3급-부탄올에서 0.48 mM:DMSO (4:1)) 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된 24mM)의 스톡 용액을 준비한다.</li>
		<li>Azido-FAM(최종 농도 50μM), TCEP(최종 1mM) 및 TBTA(최종 0.02mM)의 혼합물인 Azido-FAM(최종 농도 50μM), 웰당 최종 부피 2.25μL에서 각각 0.75μL의 혼합물의 세 가지 클릭 화학 시약을 결합합니다. 384 웰 플레이트 당 필요한 부피를 계산합니다 (즉, 384 웰 플레이트의 모든 웰이 사용되는 경우 864 μL 사용). 격렬하게 섞는다.</li>
		<li>웰당 2.25 μL의 시약 용액을 3.1.7 단계에서 완료된 384 웰 플레이트의 Lnt 반응에 직접 추가합니다.</li>
		<li>멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
		<li>CuSO4(1mM 최종 농도에 대해 24mM 스톡에서 0.75μL)를 추가하고 멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅된 384웰 플레이트에 결합
	<ol><li>1x 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 85 μL PBS-T1로 1x 세척한다.</li>
		<li>11μL의 클릭-화학 반응을 단계 3.3.6의 인큐베이션 플레이트의 각 웰로부터 단계 3.4.1로부터의 스트렙타비딘-코팅된 플레이트로 옮겨 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킨다.</li>
		<li>64 μL의 버퍼 PBS-T1을 추가합니다.</li>
		<li>스트렙타비딘-코팅된 웰에 결합하기 위한 대조군으로서 비오틴-플루오레세인(DMSO 내의 3.1 mM 스톡으로부터 0.19 μM)을 포함한다.</li>
		<li>384웰 플레이트를 RT에서 1시간 동안 열혼합기에서 300rpm으로 진탕하면서 배양합니다.</li>
		<li>다음과 같이 자동 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척하십시오 : 85 μL PBS-T2로 10 회 세척, 세척 사이에 플레이트를 흔들어줍니다. 85 μL PBS로 5회 세척하고, 세척 사이에 플레이트를 진탕한다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 검출 및 분석
	<ol><li>PBS(85μL)를 추가하고 535nm의 형광 마이크로플레이트 리더에 형광을 기록합니다.</li>
		<li>설명된 대로 데이터를 분석합니다(2.5.2단계).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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여기에 설명된 Lnt 분석을 위한 프로토콜은 트리아실화된 생성물의 형광 검출을 기반으로 민감하고 재현 가능합니다. 비오틴과 스트렙타비딘의 특이적이고 효율적인 결합은 분석의 핵심 요소입니다. Lnt 반응 완료 후 남은 알킨-POPE 기질은 또한 FAM으로 형광 표지되지만 여러 세척 단계에 의해 스트렙타비딘 플레이트 상에 결합한 후 효율적으로 제거된다. 또한, DMSO의 첨가는 Lnt 활성에 영향을 미치?...

박테리아 지단백질은 아미노 말단에서 공유 결합 지방산이 특징이며,이를 통해 막 1,2에 고정됩니다. 단백질의 성숙한 부분은 구조와 기능이 매우 다양하여 박테리아 세포 외피의 다양한 생물학적 과정에서 지단백질의 역할을 설명합니다.
지단백질은 세포질 막에 삽입 된 후 인지질 유래 지방산에 의해 변형됩니다. 프로리포단백질은 시그니처 모티프인 리포박스(lipobox)를 함유하고 있으며, 리포박스는 아실화되는 불변 시스테인 잔기와 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산을 포함합니다. 이 경로의 첫 번째 단계는 프로리포단백질 포스파티딜글리세롤::d이아실글리세릴 트랜스퍼라제(Lgt)에 의해 촉매되며, 이는 디아실글리세릴과 시스테인 사이의 티오에테르 연결을 통해 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴 그룹을 전달합니다. 신호 펩티다아제 II(Lsp)는 디아실글리세릴 프로리포단백질로부터 신호 펩티드를 절단하여, 디아실글리세릴 부분을 통해 막에 고정된 아포지단타인을 생성한다. 세 번째이자 마지막 단계는 인지질의 sn-1 위치에서 지방산을 아포지단백질에 추가하여 삼아실화된 성숙한 지단백질을 생성하는 아포지단백 N-아실트랜스퍼라제(Lnt)에 의해 촉매됩니다(그림 1)3. Lnt 반응은 안정한 티오에스테르 아실 효소 중간체가 형성되는 2단계 탁구 반응입니다. 리소포지질 부산물은 반응의 제2 단계에서 아포지단백질 기질의 아실화 전에 방출된다.
인지질 기질 특이성은 높은 비율의 트리스-트리신 우레아 SDS-PAGE4에 대한 N-아실 디아실글리세릴 펩티드의 이동성 이동에 기초한 Lnt 분석에서 결정된다. 포화 [sn-1] 및 불포화 [sn-2]의 작은 극성 헤드 그룹을 갖는 인지질이 바람직한 기질4이었다. 겔 이동 분석은 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제의 광범위한 동역학 연구 나 HTS가 억제 분자를 식별하는 데 적합하지 않습니다. 알킨 지방산을 사용한 클릭 화학은 박테리아5 의 지단백질 변형과 진핵 생물6의 지방산 대사를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 최근에, 라스 팔미토일화의 시험관내 분석이 억제제7을 확인하기 위해 보고되었다.
여기에 설명된 방법에서, 세제 중 정제된 활성 Lnt는 혼합 미셀 내의 기질과 함께 인큐베이션되어 알킨-트리아실화된 펩티드를 형성하고, 이 펩타이드는 후속적으로 형광 분광법에 의해 검출된다.

<table><tbody><tr><td>&amp;Auml;kta Purifier FPLC system</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>alkyne-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>Purity: &gt;99%&lt;br/&gt; Lnt substrate</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Purity: 100% (pure)&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td><td>BioTek</td><td>N&amp;deg; serie 115800, n&amp;deg; materiel 405 Select</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Wash steps</td></tr><tr><td>biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Purity: &amp;ge;90%&lt;br/&gt; Fluorescence control</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Purity: &amp;ge;98%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Purity: &amp;ge; 99% &amp;beta;+&amp;alpha;; &amp;lt; 15% &amp;alpha;&lt;br/&gt; Detergent for Lnt purification</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Purity: anhydrous&lt;br/&gt; Solbilization Click reagent</td></tr><tr><td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Handling reagents</td></tr><tr><td>French Pressure Cell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Cell disruption</td></tr><tr><td>FSL-1-biotin</td><td>EMC microcollections</td><td>L7030</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt substrate</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td></tr><tr><td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Purity: ~100%&lt;br/&gt; Thiol specific inhibitor</td></tr><tr><td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Foil to seal multi-well plate</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %</td><td>IBA Biotechnology</td><td>2-1201-010</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Purity: &amp;ge;13 units/mg protein&lt;br/&gt; Biotin binding</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Purity: 97%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Purity: &amp;ge;98%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Heated lid</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Purity: 10% in H2O&lt;br/&gt; Lnt reaction buffer</td></tr><tr><td>Ultra centrifuge</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Cell fractionation</td></tr></tbody></table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

프로테오박테리아의 지단백질은 3개의 통합 막 효소의 작용에 의해 막 인지질에서 파생된 지방산에 의해 번역 후 변형되어 트리아실화 단백질을 생성합니다. 지단백질 변형 경로의 첫 번째 단계는 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴기를 전달하여 디아실글리세릴 프롤리포단백질을 생성하는 것입니다. 두 번째 단계에서, 프롤리포 단백질의 신호 펩티드는 절단되어 아포지 단백질을 형성하고, 이는 차례로 인지질로부터 유래 된 제 3 지방산에 의해 변형된다. 이 마지막 단계는 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제 (Lnt)에 의해 촉매됩니다. 지단백질 변형 경로는 대부분의 γ-프로테오박테리아에서 필수적이므로 새로운 항균제 개발을 위한 잠재적인 표적이 됩니다. 여기에 설명된 것은 작은 억제 분자의 고처리량 스크리닝과 호환되는 Lnt에 대한 민감한 분석입니다. 효소와 기질은 막에 매립된 분자입니다. 따라서 체외 테스트의 개발은 간단하지 않습니다. 여기에는 세제의 존재 하에서 활성 효소의 정제, 알킨-인지질 및 디아실글리세릴 펩티드 기질의 가용성, 혼합 미셀에서의 반응 조건이 포함됩니다. 또한, 고처리량 스크리닝(HTS) 설정에서 활성 테스트를 사용하려면 결합 효소 반응보다 반응 생성물의 직접 판독이 선호됩니다. 이 형광 효소 분석에서 알킨-트리아실화 펩타이드 생성물은 클릭-화학 반응을 통해 형광으로 렌더링되고 멀티웰 플레이트 형식으로 검출됩니다. 이 방법은 인지질 및 아실 -CoA를 포함한 지방산 함유 기질을 사용하는 다른 아실 트랜스퍼 라제에 적용 할 수 있습니다.

Lnt 반응에서 인지질의 sn-1 지방산은 디아실글리세릴 펩티드로 옮겨져 성숙한 트리아실화 펩티드8을 생성합니다. 여기에 설명된 시험관 내 Lnt 분석은 알킨 지방산(알킨-POPE) 및 FSL-1-비오틴을 기질로 함유하는 인지질을 사용하여 알킨-FSL-1-비오틴을 형성하도록 설계되었습니다. azido-FAM과의 클릭 화학 반응 시 이 제품은 형광 표지를 거쳐 형광 분광법으로 검출되어야 합니다(...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

1.9K 조회수.  Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France. 여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

연구

생화학

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

생체공학

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

dNTPase SAMHD1과의 저분자 상호작용을 프로브하기 위한 고처리량 효소 결합 활성 분석

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

면역학 및 감염병학

HAT1 효소 활성을 스크리닝하기 위한 클릭 기반 분석 개발

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

저자 스포트라이트: HAT1 Inhibitor Screening을 위한 Acetyl-Click Assay 개발

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

요약

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셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

dNTPase SAMHD1과의 저분자 상호작용을 프로브하기 위한 고처리량 효소 결합 활성 분석

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석