여기에서 보고된 연구는 상 아니의 밑에 건강의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었습니다. R33 CA217702 및 학생 개발 극대화 이니셔티브(IMSD) 프로그램. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

인간 혈청 표본은 IRB 승인에 따라 자원 봉사자의 동의와 헬싱키 선언에 표현 된 원칙에 따라 얻은. 표본은 분석 실험실로 이송되기 전에 코딩및 식별을 해제했습니다.
1. 샘플 준비
<ol><li>HepG2 셀 용해
	<ol>
<li>16T75 플라스크에서 플라스크 당 약 10 x 106 HepG2 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하고 2일 동안 세포를 성장시켰다.</li>
		<li>RIPA 버퍼 준비: 50 mL 튜브에서 5 M NaCl의 1.5 mL, 1 M Tris-HCl (pH = 7)의 2.5 mL, NP-40 시약의 500 μL을 추가 한 다음 DI 물로 최종 부피를 50 mL로 가져 올립니다.</li>
		<li>리시스 버퍼 준비: ALIquot 20 mL의 RIPA 버퍼를 50 mL 튜브에 넣고 단백질과 지질 분해를 억제하기 위해 100x 프로테아제 억제제 용액의 200 μL을 추가합니다. 4 °C에 보관하십시오. 참고: 리시스 버퍼는 TBARS 시약과 호환되며 532 nm에서 흡광도를 방해하지 않습니다. 다른 리시스 버퍼를 사용하거나 리시스 버퍼에 추가 성분을 추가하려는 경우 리시스 버퍼 구성 요소가 TBARS 분석과 호환되는지 확인하기 위해 예비 유효성 검사 연구를 수행해야 합니다.</li>
		<li>10% FBS를 함유한 미디어를 제거하고 5mL의 냉멸 살균 1x PBS로 셀 2배 세척합니다.</li>
		<li>세포를 포함하는 T75 플라스크에 1mL의 용해 버퍼를 추가하고 상온(RT)에서 10분 동안 배양하여 버퍼가 잘 분산되도록 합니다.</li>
		<li>lysates를 적절하게 라벨로 2 mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 수집하고 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.</li>
		<li>리스를 5,000 x g에서 10분 동안 회전하여 셀 이물질을 수집하고 슈퍼네티를 단일 15mL 튜브로 흡인합니다.</li>
		<li>농축 셀은 50°C및 3mbar의 속도 진공을 사용하여 슈퍼쿼터를 4배 씩 분해하고 각각 94 μL의 알리쿼트를 2mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브로 만듭니다. 시험관 내 산화 및/또는 TBARS 분석에 사용될 때까지 샘플을 -80°C에 저장합니다. 참고: 세포 용해 체계를 집중하지 않으려면, 세포는 또한 1x 트립신3mL을 사용하여 분리될 수 있고, 6mL의 미디어로 중화되고, 감기 PBS5mL로 2x를 세척할 수 있다. 그런 다음 세포 펠릿을 250μL의 리시스 버퍼로 재구성할 수 있으며, 1.1.6 및 1.1.7 단계는 다음 수행될 수 있다.</li>
		<li>아세트산(pH =4)으로 35m CuCl2 스톡 용액을 준비한다.<ol>
<li>아세트산 용액 준비(pH = 4): 100mL의 DI 수에서 빙하 아세트산 1μL을 희석하십시오(pH는 약 4이어야 하지만 pH 미터로 이를 확인). pH를 4로 조정하기 위해 물 이나 아세트산을 더 넣습니다.</li>
			<li>구리 II 염화물의 약 0.1936 g의 무게를 내밀고 144mM CuCl2 재고를 만들기 위해 아세트산 용액(pH = 4)의 10mL에 용해한다. 이 용액에서 Aliquot 490 μL및 35mM CuCl2 용액을 만들기 위해 아세트산 (pH = 4)의 1,510 μL에 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>35m CuCl2 스톡 용액으로부터 의 알리쿼트 6 μL을 사용하여 세포 용액의 94 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 약 2mM의 최종 CuCl2 농도를 만듭니다. 대조군으로 사용하기 위해 94 μL의 세포 용액을 포함하는 6개의 샘플에 CuCl2 가 없는 아세트산 용액(pH = 4)의 6μL을 추가합니다. 셀 리세이트의 최종 부피는 100 μL이어야 하며, 이는 TBARS 분석에 사용될 것입니다. 참고: 구리 수산화물의 침전을 방지하기 위해 아세트산(pH = 4)으로 35m MM CuCl2 스톡 용액을 만드는 것이 필요하다.</li>
		<li>24시간 동안 37°C의 오븐에서 샘플을 배양하고 100 μL의 최종 부피를 포함하는 각 샘플에 TBARS 분석작업을 수행한다.</li>
		<li>HepG2 세포 용해제에 대한 TBARS 분석의 재현성을 확인하기 위해 별도의 일에 1.1.9 및 1.1.11 2배를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>저밀도 지단백 참고: 전형적으로, 미리 정제된 저밀도 지단백(LDL)은 EDTA의 어느 양을 포함합니다. 여기서 사용되는 LDL 샘플에는 0.01% EDTA가 포함되어 있습니다. EDTA는 LDL의 체외 Cu(II)-매개 산화를 억제할 수 있다. 따라서 실험 또는 분석 전에 LDL 샘플에서 EDTA를 제거해야 할 수도 있습니다. 1.2.1-1.2.5 단계는 이 프로세스를 설명합니다. 주의: 수산화 나트륨은 부식성이며 피부와 눈에 자극을 일으킵니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.<ol>
<li>Aliquot 24 μL은 5.51 mg/mL LDL 스톡(BSA를 표준으로 사용하여 수정된 Lowry 방법에 의해 결정된 단백질 농도)을 1mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브로 적절히 표지하였다. 필요에 따라 많은 알리코를 만들고 산화 및/또는 TBARS 분석에서 사용할 때까지 4 °C에 보관하십시오.</li>
		<li>NaOH 구슬을 사용하여 pH = 7으로 조정된 0.15 M NaCl에서 10mM HEPES 버퍼를 준비합니다: 0.49 L의 물에 NaCl 4.39 g를 용해한 다음 HEPES 1.19 g을 추가합니다. 교반 바에 잘 녹입니다. pH가 7이 될 때까지 수산화 나트륨 구슬을 추가합니다. 물로 0.5 L로 희석하십시오. 버퍼를 4°C로 저장하고 3개월 이내에 사용하십시오.</li>
		<li>10m HEPES 버퍼의 476 μL을 0.15 M NaCl(pH = 7)에 알리인용 LDL 샘플에 추가하여 최종 부피를 500 μL로 가져옵니다. 희석된 LDL 샘플을 100K 분자량 차단 장치로 0.5mL 원심 스핀 필터 장치에 추가합니다.</li>
		<li>RT에서 10분 동안 14,000 x g의 샘플을 회전하여 약 30 μL의 최종 재보전 부피를 남깁니다. 0.15 M NaCl(pH = 7)의 10m HEPES 버퍼의 480 μL에서 샘플을 재구성하고 RT에서 10분 동안 14,000xg에서 다시 회전합니다.</li>
		<li>필터 장치를 새로운 2mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브에 거꾸로 놓고 원심분리기를 1000 x g에 2분 동안 배치하여 LDL 샘플을 수집합니다(최종 부피 = 약 30 μL).</li>
		<li>Aliquot 샘플을 적절하게 표지된 1mL 튜브로 샘플링하고 각 샘플에 20 μL의 물을 추가하여 최종 부피 50 μL을 달성합니다.</li>
		<li>아세트산 내 200 μM CuCl2 스톡 용액 의 제제 (pH = 4)<ol>
<li>아세트산 용액 준비(pH = 4): 1.1.9.1 단계를 참조하십시오.</li>
			<li>144m CuCl2 스톡 용액(단계 1.1.9.2 참조), 144m CuCl2 스톡에서 알리쿼트 5.5 μL을 준비하고 200 μM 용액을 만들기 위해 4mL의 아세트산(pH= 4)의 최종 부피로 용해한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>200 μM CuCl2 스톡 용액으로부터 2.7 μL을 알리쿼트 2.7 μL을 추가하고 LDL의 50 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 ~10 μM의 최종 CuCl2 농도를 달성한다. 대조군에 사용될 LDL50 μL을 포함하는 6개의 샘플에 CuCl2 를 포함하지 않는 아세트산 용액(pH = 4)에서 2.7 μL을 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 오븐에서 2h에 대한 LDL 샘플을 배양합니다. 2시간 후, 0.15 M NaCl(pH = 7)의 10mM HEPES 버퍼를 가진 각 샘플에 대해 최종 부피를 100 μL로 가져옵니다. 즉시 TBARS 분석체를 수행합니다.</li>
		<li>TBARS 분석의 재생산성을 테스트하기 위해 2일 동안 1.2.3-1.2.9 배의 단계를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>인간 혈청
	<ol>
<li>인간 혈청 샘플에서, 2mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 각각 94 μL의 알리쿼트를 만들고 -80 °C에서 샘플을 저장합니다.</li>
		<li>아세트산(pH = 4)으로 35m CuCl2 스톡 용액을 준비하십시오( 1.1.9단계 참조).</li>
		<li>CuCl2 스톡 용액으로부터 의 알리쿼트 6 μL을 인간 혈청 의 94 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 약 2mM의 최종 CuCl2 농도를 만듭니다. 제어로 사용하기 위해 인간 혈청의 94 μL을 포함하는 6개의 견본에 CuCl2가 없는 아세트산 용액(pH = 4)의 6μL을 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 오븐에서 24시간 동안 인간 혈청 샘플을 배양하고 TBARS 분석(섹션 4)을 사용하여 산화 수준을 결정합니다.</li>
		<li>TBARS 분석의 재현성을 결정하기 위해 2일 동안 1.3.2-1.3.4 2배를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 시약 준비
주의: 티오바르비투릭 산은 피부와 눈 자극을 유발하며 흡입이나 피부 흡수로 인해 해를 끼칠 수 있습니다. 아세트산은 흡입하면 내부 장기를 손상시킬 수 있습니다. 연기 후드에 모든 산 성 솔루션을 준비합니다.
<ol><li>도데딜설페이트 나트륨(SDS) 용액 8.1% (w/v) 제제<ol>
<li>32.4 g의 SDS를 무게로 빼내고 비커에 350mL의 DI 물에 용해하십시오. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 SDS를 부드럽게 녹이고 거품을 일으키지 마십시오. 최종 볼륨을 400mL에 DI 워터로 가져와 RT에 SDS 솔루션을 저장합니다. 참고: 여기에 초과 8.1% SDS 솔루션이 준비됩니다. 그러나, 96개의 견본을 위해, 8.1% SDS 용액의 대략 20 mL만 필요합니다. 분석되는 샘플 수에 따라 이 솔루션을 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.5M 아세테이트 버퍼 준비(pH = 4)<ol>
<li>비커에 DI 수의 350 mL에 빙하 아세트산 100 mL을 희석. 마그네틱 스터디 바를 사용하여 부드럽게 녹입니다.</li>
		<li>물에 수산화 나트륨 구슬을 사용하여 6.5 M NaOH 솔루션을 준비하십시오. NAOH 구슬 13g을 디수 40mL에 녹여 DI 물로 50mL의 최종 부피를 가져옵니다.</li>
		<li>교반 바와 혼합하는 동안 아세트산 용액에 6.5M NaOH 용액의 약 46mL를 천천히 추가하십시오(pH를 4로 높여야 하지만 pH 미터를 사용하여 측정하면서 NaOH 용액을 천천히 첨가하여 확인하십시오).</li>
		<li>DI 물로 최종 볼륨을 500mL로 가져와 RT에 아세테이트 버퍼를 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>티오바르비투릭산의 0.8% 수성 용액 제제(pH = 4로 조정) 참고: 이 단계에서, 티오바르비투릭 산의 제제는 대량에 최적화되어 있으며, 이는 많은 수의 시료가 분석될 것이기 때문에(표준을 포함하지 않는 108개의 시료). 분석을 위해 계획된 샘플 수에 따라 이 솔루션을 준비합니다.<ol>
<li>수산화 나트륨 구슬과 물을 사용하여 5M 나트륨 수산화 용액을 준비하십시오 : 수산화 나트륨 구슬 4 g을 20 mL의 최종 부피로 용해하십시오. 플라스틱 용기에 보관하십시오. 이 솔루션은 각 배치에 대해 새로 준비해야 합니다.</li>
		<li>티오바르비투릭 산의 무게 4 g와 디 워터 450mL를 추가합니다. 마그네틱 스터디 바를 사용하여 부드럽게 녹입니다. 참고: 이 솔루션은 결국 500mL 총 부피로 가져올 것입니다.</li>
		<li>스티어 바와 티오바르비투릭 산을 용해하는 동안, 100 μL 증분에 5 M NaOH 용액의 약 3mL (천천히 그리고 드롭 와이즈 방식으로) 추가합니다. NaOH 용액을 추가한 후 티오바르비투르산 입자가 용해되기 시작합니다.</li>
		<li>티오바르비투르산 입자가 여전히 완전히 용해되지 않은 경우, 모든 티오바르비투릭 산 입자가 완전히 용해될 때까지 100μL 증분에 5M NaOH 용액을 더 추가합니다. 이러한 특정 용액의 경우, 티오바르비투릭 산 입자를 완전히 용해시키기 위해 5M NaOH 용액의 총 4mL이 첨가된다. 참고: 이 농도에서, 티오바르비투릭 산은 pH가 거의 4인 경우가 아니면 완전히 녹지 않을 것입니다.</li>
		<li>모든 티오바르비투릭 산이 완전히 용해 된 후 NaOH를 추가 중지합니다. pH를 4를 초과하지 마십시오. 최종 pH는 혼합 티오바르비투릭 산 용액으로부터 1 μL을 복용하여 pH 용지에 배치하여 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>최종 부피를 DI 물로 500mL로 가져와 서서0.8% 티오바르비투릭 산 용액을 RT에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 말론디알데히드 비스(디메틸 아세트탈) 표준 샘플 준비
참고: 말론다이얼데히드(MDA)는 불안정하며 시판할 수 없습니다. 그러나 MDA 테트라부틸람모늄 염, MDA 비스(디메틸 아세탈), MDA 비스(diethyl acetal)와 같이 상용화되는 다양한 화학적 형태가 있다. 이러한 세 가지 화학 형태 중 MDA 비스(dimethyl acetal)는 대부분의 연구가 동일한 표준을 사용하기 때문에 여기에서 사용됩니다21,22. MDA의 다른 두 가지 화학 적 형태를 사용하기로 선택한 경우 적합성에 대한 사전 검증이 수행되어야합니다.
<ol><li>순MDA 비스(디메틸 아세탈)의 92 μL을 DI 수의 1L에 희석하여 550 μM MDA 비스(디메틸 아세탈) 스톡 솔루션을 준비한다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 10분 동안 용액을 완전히 혼합합니다. 용액을 4°C로 저장하고 1개월 이내에 사용하십시오.</li>
	<li>디워터 1274μL의 550 μM MDA 비스(디메틸 아세탈) 스톡에서 726 μL을 희석하여 200 μM MDA 비스(디메틸 아세트탈)를 준비한다. 이 200 μM MDA 비스 (디메틸 아세트탈) 솔루션은 TBARS 분석이 수행 될 때마다 신선한 준비되어야한다.</li>
	<li>표준 곡선 준비: 8 2mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브를 가지고 200 μM 스톡에서 MDA 비스 (디메틸 아세트탈)를 추가하고 표 1에 설명 된 대로 물에 희석 H를 통해 문자 A로 라벨을 부착하십시오.</li>
	<li>8개의 유리 튜브(13mm x 100mm)를 가지고 A-H에 라벨을 붙인 다음 해당 튜브에 100 μL의 표준을 추가합니다. TBARS 분석기의 검출 한계를 계산하기 위해 빈 표준(샘플 A)에 대해 6개의 복제본을 수행합니다. 참고: 프로토콜을 1h 이하로 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>4. TBARS 분석
참고: TBARS 분석이 시작되면 멈추지 않고 완료해야 합니다.
<ol><li>샘플 수를 분석하고 샘플의 이름으로 라벨을 붙일 수 있도록 필요한 만큼 유리 튜브를 가져 가라. 그런 다음, 각 유리 튜브에 각 준비된 샘플(위에서 설명한 대로)의 100 μL을 추가합니다.</li>
	<li>각 샘플에 8.1% SDS의 200 μL을 추가하고 표준을 정하고 부드럽게 샘플을 혼합하기 위해 원형 모션으로 유리 튜브를 소용돌이.</li>
	<li>각 샘플 및 표준에 3.5M 아세테이트 버퍼(pH = 4)의 1.5mL를 추가합니다.</li>
	<li>각 시료 및 표준에 수성 0.8% 티오바르비투릭 산 용액(pH = 4)의 1.5mL를 추가합니다.</li>
	<li>700 μL의 DI 물을 추가하여 각 시료및 표준에 대해 최종 부피를 4mL로 가져옵니다.</li>
	<li>각 유리 튜브를 단단히 캡하고 1 h에 대한 95 °C로 설정 된 가열 블록에서 배양하십시오. 유리 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 튜브 꼭대기에서 응축을 방지합니다.</li>
	<li>가열 블록에서 유리 튜브를 제거하고 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.</li>
	<li>원심분리기 샘플 및 표준은 4°C에서 10분 동안 1500 x g의 샘플및 표준입니다. 원심 분리 후, RT에서 샘플 및 표준을 포함하는 유리 튜브를 유지합니다. 참고: 샘플을 얼음 또는 4°C로 유지하면 전체 샘플 또는 표준이 침전됩니다.</li>
	<li>원심분리 직후, 각 튜브에서 150 μL의 상류체를 알리쿼트하여 96웰 플레이트의 별도의 우물에 넣습니다.</li>
	<li>파이펫 팁을 사용하여 각 우물에서 거품을 제거합니다. 참고: 거품의 존재는 일관성없는 흡광도 판독값을 산출하여 높은 분석 부정확성으로 이어질 것입니다.</li>
	<li>532 nm에서 흡광도를 읽습니다. 다른 모든 흡광도 판독값에서 빈 샘플의 평균 흡광도 판독값을 뺍니다.</li>
	<li>각 표준의 알려진 농도 대 532 nm에서 빈 감도 흡수도 판독값을 플로팅하여 표준 곡선을 만듭니다. 선형 회귀를 사용하여 데이터 점을 맞춥시게 합니다. 표준 곡선에서 얻은 선형 회귀 라인의 방정식을 사용하여 알 수 없는 샘플 농도를 계산합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lipid+peroxidation+by+measuring+malondialdehyde+(MDA)+and+relatives+in+biological+samples:+Analytical+and+biological+challenges.">Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges.</a> Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).</li><li>Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+linoleic+acid+hydroperoxide+with+thiobarbituric+acid.">Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.</a> Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoid+Using+Spectrophotometric+Determination+of+Malondialdehyde+as+a+Biomarker+of+Oxidative+Stress.">Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress.</a> Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).</li><li>Morales, M., Munn&#233;-Bosch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde:+Facts+and+artifacts.">Malondialdehyde: Facts and artifacts.</a> Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).</li><li>Devasagayam, T. 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W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+cytotoxicity+induced+by+free+radical+peroxidation+of+lipid.">Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid.</a> Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).</li><li>Guzm&#225;n-Chozas, M., Vicario-Romero, I. 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New Evidence for a Multistep Mechanism.</a> Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).</li><li>Jeffs, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delta-S-Cys-Albumin:+A+Lab+Test+that+Quantifies+Cumulative+Exposure+of+Archived+Human+Blood+Plasma+and+Serum+Samples+to+Thawed+Conditions.">Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).</li><li>Yagi, K., Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Assay+for+the+Level+of+Total+Lipid+Peroxides+in+Serum+or+Plasma.">Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma.</a> Free Radical and Antioxidant Protocols. 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B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li><li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+(F+2-isoprostanes)+in+plasma+during+collection+and+storage.">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li><li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde+in+Stored+Plasma.">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+GC-MS/MS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma:+Effects+of+long-term+L-arginine+administration.">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li></ol>

저자는 경쟁 적인 재정적 이익 이나 공개 하는 이해의 다른 충돌.

그 한계에도 불구하고1,3,4,8,9,10,12,12,13,14,15,19 및 실험실 사이의 비교에 대한 적합성의 부족에도 불구하고, TBARS 분석은 가장 오래된 중 하나입니다<sup...

지질 과산화는 반응성 산소 종 및 반응성 질소 종과 같은 자유 라디칼이 지질의 탄소 탄소 이중 결합을 공격하는 과정으로, 탄소로부터의 수소의 추상화와 산소 분자의 삽입을 수반하는 과정입니다. 이 과정은 주요 제품으로 지질 페록실 라디칼, 하이드로퍼산화물, 말론다이얼데히드(MDA) 및 4-하이드록시논날을 주요 이차 제품으로 포함하는 복잡한 제품의 혼합물로 이어집니다1.
MDA는 티오바르비투릭 산 (TBA)과의 촉진 반응으로 인해 지질 과산화의 마커로 생물 의학 연구에서 널리 사용되었습니다. 반응은 MDA-TBA2의 형성으로 이끌어 냅니다, 532 nm에서 가시 스펙트럼에서 흡수하고 빨간 분홍색 색깔2를 생성하는 합자. MDA 외에 지질 과산화에서 파생 된 다른 분자는 또한 TBA와 반응하고 532 nm에서 빛을 흡수 할 수 있으며, 측정되는 전반적인 흡수 신호에 기여합니다. 유사하게, MDA는 생체 분자의 대부분의 그밖 주요 종류와 반응할 수 있습니다, 잠재적으로 TBA3,4를 가진 반응에 대한 그것의 접근성을 제한합니다. 이와 같이, 이 전통적인 분석은 단순히 측정 하는 것으로 간주 됩니다 "티오 바르 비 투 릭 산 반응 물질" 또는 TBARS5.
올바르게 적용되고 해석될 때, TBARS 분석법은 일반적으로 생물학적 샘플6에서 산화 스트레스의 전반적인 수준을 나타내는 좋은 지표로 간주됩니다. 불행하게도, Khoubnasabjafari 와 다른 사람에 의해 문서화 된 바와 같이, TBARS 분석은 종종 수행되고 모호한 결론을 용이하게하는 방법으로 해석3,4,7,8,9,10,11. 이에 대한 원인은 주로 샘플 관련 사전 분석 변수와 분석 결과에 상당한 변화없이 분석 프로토콜의 겉보기 사소한 변화를 금지하는 분석 견고성의 부족에 뿌리를 두고 있습니다11,7,12,13.
바이오시메시 처리 및 저장과 관련된 사전 분석 변수(예를 들어, 혈장은 일시적으로 -20°C)14,15에 TBARS 분석 결과 16,17에 큰 영향을 미칠 수 있다; 따라서 TBARS 분석 결과는 명시적 실험실 간 분석 유효성 검사 데이터에 의해 보증되지 않는 한 다른 실험실에서 비교해서는 안 됩니다. 이 권장 사항은 서양 얼룩이 일반적으로 사용되고 해석되는 방식과 비슷합니다. 밴드 밀도의 비교는 내부 블롯과 아마도 실험실 내 연구에 유효하지만 실험실 간의 대역 밀도비교는 일반적으로 잘못된 관행으로 간주됩니다.
몇몇 연구원은 TBARS 분석에 의해 측정된 MDA가 단순히 허용가능한 biomarker3,9,10,18,19의 요구된 분석 또는 임상 기준을 충족하지 않는다는 것을 건의했습니다. 실제로, 분석이 50 년 전에 개발되지 않았다면, 그것은 아마 오늘날 널리 사용되고 암묵적 인 수용성을 얻지 못했을 것입니다. 산화 스트레스를 결정하는 데 사용되는 더 큰 분석 감도, 특이성 및 견고성을 가진 다른 분석이 있지만, 532 nm의 흡수도에 기초한 TBARS 분석법은 지질 과산화의 결정에 가장 일반적으로 사용되는 분석 중 하나까지 남아 있으며, 따라서 산화 스트레스의 평가.
TBARS 분석법은 고가의 키트(400달러 이상)로만 찾을 수 있으며, 지침은 사용되는 대부분의 시약 농도에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다. 또한 제공된 시약은 키트당 하나의 컬러메트릭 표준 곡선만 만들 수 있기 때문에 하나의 실험에만 사용할 수 있습니다. 동일한 표준 곡선을 여러 번 사용할 수 없기 때문에 이것은 다른 시점에서 몇 가지 샘플 내에서 산화 수준을 결정하려는 연구자에게 문제가 될 수 있습니다. 따라서 여러 실험을 위해 여러 키트를 구입해야 합니다. 현재 고가의 키트를 구입하지 않는 한 TBARS 분석기를 수행하는 방법에 사용할 수 있는 자세한 프로토콜이 없습니다. 과거에 일부 연구자들은 TBARS 분석21,22를 수행하는 방법을 모호하게 설명했지만, 고가의 키트없이 TBARS 분석법을 수행하는 방법에 대한 완전히 상세한 프로토콜이나 포괄적 인 비디오는 문헌에서 사용할 수 없습니다.
여기에서는 간단하고 재현 가능하며 저렴한 방법으로 TBARS 분석기를 수행하는 방법에 대한 자세한 분석 검증 방법론을 보고합니다. 인간 혈청의 지질 과산화의 변화, HepG2 용해, Cu(II) 이온을 치료할 때 저밀도 지단백은 TBARS 분석에 대한 예시적인 응용 프로그램으로 입증된다. 결과는 이 TBARS 분석이 매일 일관되고 재현가능한 것으로 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>1x Sterile PBS pH 7.4 1 L</td><td>VWR, PA</td><td>101642--262</td><td>cell lysis reagent</td></tr><tr><td>50 mL self-standing centrifuge tube</td><td>Corning, NY</td><td>CLS430897</td><td>General material</td></tr><tr><td>96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA</td><td>280895</td><td>To measure absorbance</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>UFC510024</td><td>LDL purification</td></tr><tr><td>Caps for glass tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA</td><td>14-930-15D</td><td>for TBARS assay</td></tr><tr><td>Copper II Chloride</td><td>SIGMA, MO</td><td>222011-250G</td><td>to induce oxidation</td></tr><tr><td>Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)</td><td>VWR, PA</td><td>53283-800</td><td>for TBARS assay</td></tr><tr><td>Eagle&#039;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td><td>ATCC, VA</td><td>HB-8065</td><td>HepG2 cell media</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td><td>eppendorf, NY</td><td>22363204</td><td>General material</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL</td><td>Genesee Sceitific, CA</td><td>22363352</td><td>General material</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum US Source</td><td>Omega Scientific, CA</td><td>FB-11</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>SIGMA, MO</td><td>27225-1L-R</td><td>TBARS Reagent</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>87786</td><td>cell lysis reagent</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA, MO</td><td>H3375-250G</td><td>LDL solvent</td></tr><tr><td>HepG2 Cells</td><td>ATCC, VA</td><td>HB-8065</td><td>Biological matrix prototype</td></tr><tr><td>Hydrocloric acid (HCl)</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>A144-212</td><td>cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Legend Micro 17 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>75002431</td><td>General material</td></tr><tr><td>Low Density Lipoprotein, Human Plasma</td><td>Athens Research &amp;amp; Technology, GA</td><td>12-16-120412</td><td>Biological matrix prototype</td></tr><tr><td>Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment</td><td>VWR, PA</td><td>58948-025</td><td>General material</td></tr><tr><td>Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)</td><td>SIGMA, MO</td><td>8207560250</td><td>TBARS Standard</td></tr><tr><td>Multiskan Go Microplate Spectrophotometer</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>51119200</td><td>To measure absorbance</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>EMD Millipore Corp, MA</td><td>492016-100ML</td><td>cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>SIGMA, MO</td><td>S7653-1KG</td><td>cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>SIGMA, MO</td><td>436143-100G</td><td>TBARS Reagent</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>SIGMA, MO</td><td>367176-2.5KG</td><td>TBARS Reagent</td></tr><tr><td>SpeedVac Concentrator</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>SC250EXP</td><td>For concentrating cell lysates</td></tr><tr><td>T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap</td><td>USA Scientific, FL</td><td>658175</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>Thiobarbituric Acid</td><td>SIGMA, MO</td><td>T5500-100G</td><td>TBARS Reagent</td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fluka, GA</td><td>93362</td><td>cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Trypsin (1x)</td><td>VWR, PA</td><td>16777-166</td><td>To detach HepG2 cells</td></tr></tbody></table>

evaluation of oxidative stress in biological samples using the thiobarbituric acid reactive substances assay

제한된 분석 특이성과 견고함에도 불구하고 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석법은 생물학적 유체의 지질 과산화의 일반적인 지표로 널리 사용되고 있습니다. 시료가 적절히 처리되고 저장되었다는 경우 생물학적 시료 내에서 산화 스트레스 수준을 나타내는 좋은 지표로 간주됩니다. 분석은 지질 과산화 제품의 반응을 포함, 주로 말론 다이얼데히드 (MDA), 티오 바르비투산 (TBA),TBAR라는 MDA-TBA2 어덕트의 형성에 이르게. TBARS는 532 nm에서 분광측정으로 측정할 수 있는 빨간색 분홍색 색상을 생성합니다. TBARS 분석법은 산성 조건(pH = 4) 및 95°C에서 수행됩니다. 순수 MDA는 불안정하지만 이러한 조건은 MDA 비스 (디메틸 아세탈)에서 MDA의 방출을 허용하며, 이는이 방법의 분석 표준으로 사용됩니다. TBARS 분석법은 약 2시간 안에 완료할 수 있는 간단한 방법입니다. 분석 시약의 준비는 여기에서 자세히 설명되어 있습니다. 예산에 민감한 연구원은 단일 표준 곡선의 시공을 허용하는 고가의 TBARS 분석 키트를 구입하는 대신 저렴한 비용으로 여러 실험에 이러한 시약을 사용할 수 있습니다 (따라서 하나의 실험에만 사용할 수 있습니다). 이 TBARS 분석법의 적용성은 인간 혈청, 저밀도 지단백 및 세포 용해에서 나타난다. 분석은 일관되고 재현 가능하며 1.1 μM의 검출 한계에 도달 할 수 있습니다. 분광성 TBARS 분석기의 사용 및 해석에 대한 권장 사항이 제공됩니다.

산성 조건(pH = 4)과 95°C에서 말론다이얼데히드(MDA) 비스(디메틸 아세트탈)는 MDA23을 산출한다. MDA와 밀접한 관련이 있는 화학 콘게너들은 티오바르비투르산(TBA)의 두 분자와 반응하여 티오바르비투릭 산 반응성 물질(TBARS)이라고 불리는 화합물을 생산하여 붉은 분홍색 색상을 주고 532nm에서 흡수성 λmax 를 갖는다(도 1, 도 2). MDA ...

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Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석의 목표는 532 nm에서 가시파장 분광측을 사용하여 지질 과산화 제품, 주로 말론다이얼데히드의 생산을 측정하여 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 평가하는 것입니다. 여기에 설명된 방법은 인간 혈청, 세포 리스, 저밀도 지단백에 적용될 수 있다.

티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석체를 이용한 생물학적 시료의 산화 스트레스 평가

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic ...

evaluation-oxidative-stress-biological-samples-using-thiobarbituric

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

27.9K 조회수.  Arizona State University. 티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석의 목표는 532 nm에서 가시파장 분광측을 사용하여 지질 과산화 제품, 주로 말론다이얼데히드의 생산을 측정하여 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 평가하는 것입니다. 여기에 설명된 방법은 인간 혈청, 세포 리스, 저밀도 지단백에 적용될 수 있다.

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

연구

암 연구학

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

생화학

Ecotoxicological Methodologies to Evaluate Biomarkers at Different Scales in Neotropical Anurans

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that improve not only the interpretation of the effects of environmental stressors on organisms but also the determination of their possible impact. It is well known that the use of ecotoxicological biomarkers at different levels of organization allows for the prediction of the biological responses of organisms to environmental stressors, which is useful in environmental risk assessment. 
Nevertheless, it is necessary to consider the optimization of basic procedures, to generate historical data in control groups, and to employ specific bioassays to evaluate responses in organs and tissues in order to elucidate the nature and variation of the effects observed. Therefore, the present work aims to describe several ecotoxicological methodologies employed in all stages of neotropical anurans at different ecological levels and to validate them as useful biomarkers to be used both in wildlife and in laboratory conditions. In this work, these biomarkers were applied at the individual/organismic level (body condition index), histological/physiological level (histopathology, histometric, and pigmentary analyses), biochemical level (oxidative stress enzymes), and genetic level (direct and oxidative damage in DNA by comet assay). 
Although these methodologies have small variations or modifications depending on the species, these techniques provide effective biomarkers for evaluating the effect of xenobiotics on anurans, which possess certain characteristics that make them useful indicator species of aquatic and terrestrial ecosystems. In conclusion, the battery of biomarkers employed in the present study has proven to be adequate for estimating toxic responses in Neotropical anurans and can be further recommended as bioindicators for identifying the impact of pollutants on the aquatic ecosystems of the region. Finally, it is recommended to achieve the standardization of these important biomarkers for anurans in specific regions as well as to possibly include them in risk assessments and decision-making.

<meta charset="utf8"></head><body>신열대성 아누란에서 다양한 규모의 바이오마커를 평가하기 위한 생태독성학적 방법론

In this paper, standardized ecotoxicological methods for the evaluation of biomarkers in neotropical anuran species are presented. Specifically, this paper details several methodologies at different scales of ecotoxicological evaluation, such as the genetic, cellular-histological, biochemical, morphological, and individual levels.

신열대성 아누란에서 다양한 규모의 바이오마커를 평가하기 위한 생태독성학적 방법론

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that ...

환경과학

Hellgrammite as a Non-Conventional Biomonitor for Surface Water and Environmental Health Assessment

The larvae of dobsonflies from the genus Corydalus, commonly known as Hellgrammites, are characterized by their notable size, extensive range of occurrence, and extended period of immaturity, which can last up to one year. Hellgrammites are clearly known to exhibit sensitivity to pollution and habitat structure impacts. Given these unique features, using Corydalus texanus larvae is highly suitable as reliable biomonitoring agents to assess the ecological integrity of aquatic ecosystems. This protocol aims to provide the necessary tools for C. texanus assessment and demonstrate their efficacy through a case study. Research findings have practical implications, indicating that C. texanus larvae exhibit early-warning responses to mining pollution, bioaccumulating high amounts of heavy metals such as Zn, Fe, and Al. The presence or absence of C. texanus populations may serve as a helpful indicator for identifying potential issues related to ecosystem health. The unconventional approach has shown early warnings of pollution in mining-impacted sites, highlighting the need for timely action to protect the environment. Given their unique traits, the use of C. texanus larvae is highly suggested as a reliable non-conventional bioindicator.

This protocol describes the use of biomarkers for the early detection of deleterious impacts in aquatic ecosystems. The biomarkers are closely related to sentinel traits, and their changes aid in detecting early-warning damages.

The larvae of dobsonflies from the genus Corydalus, commonly known as Hellgrammites, are characterized by their notable size, extensive range of ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed procedure of a quantitative redox proteomics method that utilizes resin-assisted capture (RAC) in combination with tandem mass tag (TMT) isobaric labeling and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to allow multiplexed stochiometric quantification of oxidized protein thiols at the proteome level. The site-specific quantitative information on oxidized cysteine residues provides additional insight into the functional impacts of such modifications. 
The workflow is adaptable across many sample types, including cultured cells (e.g., mammalian, prokaryotic) and whole tissues (e.g., heart, lung, muscle), which are initially lysed/homogenized and with free thiols being alkylated to prevent artificial oxidation. The oxidized protein thiols are then reduced and captured by a thiol-affinity resin, which streamlines and simplifies the workflow steps by allowing the proceeding digestion, labeling, and washing procedures to be performed without additional transfer of proteins/peptides. Finally, the labeled peptides are eluted and analyzed by LC-MS/MS to reveal comprehensive stoichiometric changes related to thiol oxidation across the entire proteome. This method greatly improves the understanding of the role of redox-dependent regulation under physiological and pathophysiological states related to protein thiol oxidation.

Protein thiol oxidation has significant implications under normal physiological and pathophysiological conditions. We describe the details of a quantitative redox proteomics method, which utilizes resin-assisted capture, isobaric labeling, and mass spectrometry, enabling site-specific identification and quantification of reversibly oxidized cysteine residues of proteins.

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

GSH/GSSG 측정 – 항산화 연구를 위한 정제된 OPA 분석

Rapid Quantification of Oxidized and Reduced Forms of Glutathione Using Ortho -phthalaldehyde in Cultured Mammalian Cells In Vitro

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive oxygen species studies. The method utilizes Ortho-phthalaldehyde (OPA) to quantify the cellular concentration of glutathione(s). OPA conjugates with reduced glutathione (GSH) via sulfhydryl binding to subsequently form an isoindole, resulting in a highly fluorescent conjugate. To attain an accurate result of both oxidized glutathione (GSSG) and GSH, a combination of masking agents and reducing agents, which have been implemented in this protocol, are required. Treatments may also impact cellular viability. Hence, normalization via protein assay is presented in this multiparametric assay. The assay demonstrates a pseudo-linear detection range of 0.234 - 30&#181;M (R2=0.9932&#177;0.007 (N=12)) specific to GSH. The proposed assay also allows for the determination of oxidized glutathione with the addition of the masking agent N-ethylmaleimide to bind reduced glutathione, and the reducing agent tris(2-carboxyethyl) phosphine is introduced to cleave the disulfide bond in GSSG to produce two molecules of GSH. The assay is used in combination with a validated bicinchoninic acid assay for protein quantification and an adenylate kinase assay for cytotoxicity assessment.

저자 스포트라이트: 산화 스트레스 연구를 위한 혁신적인 티올 정량화 및 바이오마커 검출 

Quantification of both oxidized and reduced forms of glutathione (GSSG and GSH, respectively) has been achieved through the use of Ortho-phthalaldehyde (OPA). OPA becomes highly fluorescent once conjugated to GSH but is unable to conjugate GSSG until reduced. Here, we describe a multiparametric assay to quantify both using protein quantification for normalization.

In vitro에서 배양된 포유류 세포에서 ortho -phthaldehyde를 사용한 산화 및 환원 형태의 글루타치온의 신속한 정량화

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석체를 이용한 생물학적 시료의 산화 스트레스 평가

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신열대성 아누란에서 다양한 규모의 바이오마커를 평가하기 위한 생태독성학적 방법론

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Hellgrammite as a Non-Conventional Biomonitor for Surface Water and Environmental Health Assessment

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

In vitro에서 배양된 포유류 세포에서 ortho -phthaldehyde를 사용한 산화 및 환원 형태의 글루타치온의 신속한 정량화

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동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링