저자는 Katelyn Lavrich 실험 설계 및 원고 편집에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

1입니다. 셀의 준비
참고:이 절차는 불멸 하 게 셀 라인 (BEAS-2B; lentiviral 변환을 설명 합니다. ATCC, 머내서스, VA) 원하는 기자 roGFP2 (하이퍼)을 표현 하. 다른 셀 라인/형식 및 유전자 이동, transfection, 등의 방법으로 그들은 기자 식 시각화 보기의 필드 (일반적으로 5-10의 세포) 당 센서 표현 세포의 충분 한 수를 적절 한 수준에서 결과 활용할 수 있습니다. 분석 방법에 대 한 궁극적으로 사용 될 접시에 절차를 수행 해야 경우 transfection 방법 (예: transfect 현미경에 나타납니다 같은 접시에 셀). 아래 설명 하는 단계 6-잘 셀 문화 판에서 셀 transductions 준비에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 이 형식이 원하는 응용 프로그램에 대 한 적절 한 크기, 다른 배를 교체하실 수 있습니다.
<ol><li>정상적인 성장 미디어에 약 40-60% 합류 세포 성장. 참고:이 연구는 인간 기관지 상피 세포 선, BEAS-2B keratinocyte 성장 매체 (KGM)에서 재배를 활용.</li>
	<li>변환, 직전 셀에 성장 매체를 수식에 의해 계산으로 바이러스의 적절 한 금액을 포함 하는 혈 청 자유로운 미디어의 500 µ L 바꿉니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq1.jpg"><ol>
<li>BEAS 2B 셀의 변환에 대 한 혈 청 무료 keratinocyte 기저 매체 (KBM) 사용 하 여 바이러스 성 외피 동안 KGM 성장 매체를 대체. 참고: 위의 계산 셀 6 잘 형식에의 한 잘 단일 변환입니다. 필요한 경우, 수행의 여러 transductions 우물 불리고 수 하는 우물의 수 곱셈와 수식을 조정 하 여 수행할 수 있습니다. 5와 20 사이 감염 (MOI)의 다양성을 사용 하 여 lentiviral transductions에 대 한 있습니다. Adenoviral transductions 100과 500 사이의 나 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C 4 h, 간단한 락으로 30 ~ 60 분 마다 접시에 바이러스 성 입자를 재배포 또는 모션 소용돌이에서 바이러스 혼합 셀을 품 어.</li>
	<li>접시에 완전 한 성장 매체의 1 mL을 추가 하 고 추가 4-16 h는 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>모든 미디어를 제거 하 고 신선한 완전 한 성장 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>계속 성장 하 고 셀 통로, 필요에 따라 확장 합니다. 참고: 셀 appreciably 표현 12-48 시간 내 센서를 시작 한다. Lentiviral 벡터 변환에 대 한 사용 되었습니다, 원하는 센서의 안정적인 식 구절에 걸쳐 계속 해야 합니다.</li>
	<li>현미경-기반 평가 대 한 유리로 씨 셀 현미경 요리 바닥과 이미징 전에 원하는 합류 (≥70-80%)을 성장. 참고: 밀도 시드 접시 크기, 사용 되 고 세포 선의 성장 율 시드 다음과 같은 평가의 시간에 따라 달라 집니다. 예를 들어 씨앗 300000 BEAS 2B 세포 성장의 1 일 후 약 70-80% 합류를 35 mm 접시에.</li>
</ol>2. 현미경 설치
참고: 아래에 설명 된 프로토콜 404 및 488 nm 레이저 라인을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 수행 됩니다. 그들의 처방된 업무가/방출에이 프로토콜에서 설명 하는 센서의 fluorometric 평가 만들기의 다른 방법을 해야 합니다 또한 가능한 데이터 얻을 수 있습니다. 중요 한 것은, 장비 설정 유형, 나이, 악기 사용 되 고;의 상태에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 따라서, 어떤 악기 값을 언급 한 다른 실험실에서 사용 하는 장비에 특정 하지 않을 수 있습니다.
<ol><li>적절 한 온도 (예를 들어, 37 ° C) 습도 유지 하기 위해 환경 제어를 사용 하 여 모든 이미징 분석 수행 (일반적으로 > 95% 상대 습도), 및 가스 농도 (예를 들면, 5% CO2) 걸쳐 셀에 대 한 적합 한는 실험의 기간입니다.</li>
	<li>상대 습도의 높은 값을 사용 하는 경우 유지 습도 분위기 접촉 수 있습니다 어떤 표면 든 지 (예., 현미경 목표) 이상 약간 온도에 습도 응축을 방지 하기 위해 생성 됩니다. 이 객관적인 히터 테이프 및 적절 한 히터 제어 난방의 사용으로 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>현미경의 모든 구성 요소를 켜고, 510에서 방출 된 488 고 404 nm에서 순차 구동에 필요한 모든 장비를 설정 nm. 광 구성의 모든 구성 요소 실시간 획득에 대 한 적절 하 게 설정 되어 확인 하십시오.</li>
	<li>37 ° c, 5% CO2 분위기, 일정 한 온도 유지 하기 위해 무대 상단 환경 챔버 설정 및 > 95% 습도. 이미지 수집을 시작 하기 전에 모든 환경 컨트롤의 초기 설정 후 적어도 10 분 동안 환경 챔버를 equilibrate. 참고: 환경 조건 제거 또는 실험 길이, 셀 형식, 사용 되 고 노출에 따라 조정 될 수 있습니다.</li>
	<li>환경 챔버 내 무대 위에 셀 (단계 1.7)의 접시를 놓습니다.</li>
	<li>원하는 대물 렌즈와 접 안 렌즈와 하얀 빛을 사용 하 여 셀의 초점면 찾아서 정상적인 형태를 보장. 참고: 1.4 나 60 X 바이올렛-수정, 오일 몰입 렌즈 일반적으로 사용을 허용 하는 confocal 시스템의 광학 해상도 극대화 하면서 세포내 구획의 식별.</li>
	<li>보기의 필드에 있는 셀의 형광 식을 확인 합니다. 적절 한 필터 세트, fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 넓은 필드 형광 조명 아래 셀을 시각화 하는 동안 그것을 할. 이 시점에서, 사용 하 여 넓은 필드 조명 동안 있기 때문에 쉽게 공부 하는 셀의 필드를 선택 하려면 요리를 이동 하는 접 안 렌즈를 통해 보고 하는 것이 더 편리. 일반적으로, 녹색 형광으로 표시, 센서를 표현 하는 적어도 5 ~ 10 셀을 포함 하는 필드의 보기를 선택 합니다.<ol>
<li>또는, confocally 표현 되는 센서와 가장 호환 되는 파장에서 레이저 여기를 사용 하 여이 평가 수행 (488 nm는 일반적으로 최고의 작품). 주: 그들의 본질적인 형광 속성으로 인해 그것은 더 어려울 것 이다 어느 FITC를 사용 하 여 그 표현 roGFP2 보다 하이퍼를 표현 하는 세포를 구상 하 또는 488 nm. 그러나, 그것은 여전히 희미 한 셀 참조 가능 해야.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 보기 필드 발견 되 면 환경 챔버를 닫습니다. 참고: 연구를 통해 안정적인 초점 비행기의 유지 보수를 용이 하 게 하 고급 현미경 스탠드에서 자주 사용할 수 초점 유지 기능을 사용.</li>
	<li>원하는 노출 기간에 걸쳐 관심의 센서의 최적의 평가 보장 하기 위해 수집 매개 변수를 설정 합니다. 다음은 권장 사항 및 센서 응답의 confocal 영상에 대 한 접근:<ol>
<li>488 nm에서 여기 및 방출 510에 대 한 레이저 전원 조정 nm. 셀, 시각화 수 있도록 레이저 전력 레벨을 선택 하 고 이것을 샘플 또는 복제 요리 사이 일정 하 게 유지. 참고:이 연구를 위해 12%와 1.5% 레이저 전원 사용 되었다 488 고 404 nm 레이저 라인에 각각.</li>
		<li>수집 소프트웨어의 confocal 컨트롤을 사용 하 여 선택 된 초점 비행기는 488에서 검색 하 여 셀 (z 축)의 중심에서 최대한 형광 방출 강도 대 한 최적화 된 z-비행기를 조정 하는 동안 nm. 이것은 쉽게 가장 과다 노출 된 세포에서 z-비행기에 대 한 검색 하는 동안 높은 이득 설정을 사용 하 여 이루어집니다. 적절 한 초점 비행기 발견 되었습니다 일단 관찰 되 고 픽셀 밀어붙이는 없이 사용 되 고 기자의 형광에 대 한 가장 최적의 설정에 이득을 반환 합니다. 참고: 레이저와 이득 설정을 발견 하 고 실험 하는 동안 세포 관찰에 적합는 완전히 사용 되 고 confocal 시스템에 의존 합니다. 일반적으로, 일단 셀 보기의 필드에서 발견 되었습니다, 그것 것이 좋습니다 최소한 레이저 힘의 사용 (일반적으로 ≤20%), 고성능 레이저 빛을 사용 하 여 셀의 과도 한 스캐닝 센서에 의해 산화 변화 감지 유도 수 있습니다.</li>
		<li>이득을 사용 하 여 초기 형광을 세밀 하 게 조정. RoGFP2와 이러한 셀 EGSH 가 증가 하면 488 nm 여기에 의해 유도 된 510 nm 형광 잃게됩니다-채도 없이 악기의 상한 (≈ 90% 상대 강도) 근처 기준선을 설정 합니다. 488 nm 여기 형광 강도 이어야 한다 반면, H2O2 감지 되 면 이러한 세포 510 nm의 형광 강도 얻을 것 이다 세포를 표현 하는 하이퍼에 대 한 기준선에서 낮은 (≈ 10% 상대 강도).</li>
		<li>2.9.2-404 nm에서 여기와 510에서 방출 2.9.3 단계 반복 nm. 이득 404 nm 여기 파장에 대 한 설정은 각 센서에 대 한 488 nm 여기 사용 된 반대 (즉, 낮은 기준 형광 (≈ 10% 상대 강도) 404에서 roGFP2,2 H에 대 한 높은 기준 형광 (≈ 90% 상대 강도)에 대 한 nm O2 센서). 참고: 일반적으로 404 nm 여기에 형광 (510 방출) 상당히 낮은 것 보다 셀에 488 nm 여기 얻을 수 roGFP2와 하이퍼, 404 nm 피크로는 상대적으로 경미한 흥분이 모두에 게 최대 센서입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 수집
<ol><li>수집 소프트웨어를 순차적으로 두 여기 파장을 흥분 시키기 위해 설정 (첫 번째 488 nm 그리고 404 nm) 510에 대 한 배출량을 수집 하 고 실험의 원하는 길이 걸쳐 미리 정해진된 시간 간격에 nm (예: 캡처 이미지 마다 60 60 분에 대 한 s)입니다.<ol>
<li>또는, 이미지 수동으로 노출 전후 경우 수집할 변경 EGSH 또는 H2O2 에 대략적인 타이밍 테스트 되 고 xenobiotic 알려져 있습니다. 그러나,이 시간 해상도의 손실이 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험적인 매개 변수의 실시간 평가 대 한 필드에 적어도 5-10 센서 표현 셀을 선택 하 고 관심 ("ROIs") 실험 기간 동안 그들의 형광 변화를 모니터링 하는 영역으로 그들을 설정 합니다. 참고:이 단계는 선택 사항, 그리고 실시간으로 직접 관찰 하는 것은 바람직하지 않다 또는 소프트웨어 제한 방지 연속 모니터링 하는 경우 실험 후 수행할 수 있습니다. 세포 인구에 따라 ROIs로 셀을 표현 하는 센서의 선택 셀에 걸쳐 식 레벨의 범위를 나타낼 수 있습니다.<ol>
<li>이러한 연구에 대 일 분 기준 기간 후 환경 toxicant 9, 10-phenanthrenequinone (9, 10-PQ) 또는 과산화 수소 (H2O2)를 추가 합니다.</li>
		<li>이 프로토콜에서 나중에 사용에 대 한 모든 시 약을 준비 합니다.  9, 10-15 m m의 농도에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 PQ를 녹이 고 250 µ M 작업 솔루션을 기저 세포 미디어에 희석.  또한, 주입 시 1 m m의 최종 농도 얻을 것 이다 물에 과산화 수소의 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험적인 매개 변수를 정의한 후 시간 과정 취득을 시작 합니다. Xenobiotic 노출 시작 전에 적어도 5 분 (또는 5 데이터 요소)의 초기 계획 기간을 설정 합니다.</li>
	<li>노출 하는 toxicant 세포 생체 외에서 주입에 대 한 기존의 접근을 사용 하 여 조사 되 고. 물 또는 다른 적절 한 용 매에 녹는 화합물을 준비 하 고 미디어에 직접 주사.<ol>
<li>유기 용 매 (예: 디 메 틸 sulfoxide 또는 에탄올) 필요한 경우, 마지막 용 매 농도 0.1% 이하로 유지. 솔벤트 셀의 별도 접시에 차량 제어 전자GSH 또는 H2O2 생산에 영향을 생성 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
		<li>더 낮은 가용성을 가진 화합물, 혼합 단계 주입 후 micropipette 프로토콜을 사용 하 여 추가 합니다. 적절 한 캐리어 가스 혼합물을 사용 하 여 환경 챔버에 직접 가스 노출 펌프.</li>
	</ol>
</li>
	<li>노출 기간 동안 형광에 변화를 모니터링 합니다. 필요에 따라 다음 주사를 수행 합니다. 상당한 주의 하지 주사, 중 접시를 이동 하기 위하여 동일한 셀 같은 초점면에서 촬영 하는 동안 전체 시간 내내 뒤를.</li>
	<li>실험의 끝에, 적절 한 컨트롤에 셀을 표시 합니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서에 대 한 화합물 산화와 감소의 그들의 비율 응답 지적된 데모에 이러한 센서의 특정 농도 추가 합니다. H2O2 와 dithiothreitol (DTT) 산화 하 고 두 센서를 줄이기 위해 적절 한 컨트롤로 제공 합니다. 일반적으로, 100-1000 µ M H2O2, 1-5 m m dithiothreitol (DTT), 뒤의 최종 농도 사용자를 완전히 산화 하 고 이러한 센서를 줄일 수 있습니다.<ol>
<li>이러한 연구에 대 한 최대 센서 응답을 결정 하기 위해 5mm DTT 뒤 1 m m H2O2 를 사용 합니다.</li>
		<li>응답, 센서 수 있도록 적어도 5 분을 기다려야 하 고 원제, DTT는 세 뇨 르를 형광 또는 설립된 기준선 근처의 수준에 반환 등을 주사. 참고:이 단계에서 컨트롤의 사용 정규화에 대 한 중요 한 이며 각 셀에 센서의 동적 범위를 결정 하는 모든 실험의 끝에 실행 되어야 한다. RoGFP2를 위한 aldrithiol 또한 실험의 끝에 추가할 수 있습니다. Aldrithiol 센서를 직접 산화 roGFP2 redox 릴레이 무시 합니다. 다음 xenobiotic 노출 센서 기능을 평가 하기 위해 유용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>설정 되지 않은 경우 분석할 셀 주위 ROIs를 그립니다. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 각 ROI 시간 과정을 통해 각 파장에서의 형광 강도 측정. 셀 이동 하지 않았다 또는 접시 실행 하는 동안 이동 하지 않은 확인 하십시오. 참고: ROIs 설립 동봉된 영역 각 셀의 형광 식 패턴을 그려서 가장 쉽게 이루어집니다. 더이 과정을 돕기 위해, 설립된 시야 내에서 셀의 빛 (또는 명시) 이미지를 전송된 셀 경계를 정의 하는 노력에 형광 이미지 위에 중첩 수 있습니다. 그러나, 전송된 빛 이미지를 사용 하 여 사용자를 실험의 과정을 통해 추가 채널 (이미지의 집합)를 잡으려고 합니다. 또는, 특정 제조 업체 ROIs 더 양적, 덜 주관적 방법 설치 하기 위하여 강도 임계값 같은 특정 매개 변수를 사용 하는 이미징 소프트웨어에 알고리즘을 통합 합니다.</li>
	<li>원하는 분석 소프트웨어 (예: 전자 스프레드시트)를 내보냅니다.</li>
	<li>수식을 사용 하 여 각 시간 지점에서 각 ROI에 대 한 비율 센서 응답을 계산: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq3.jpg">
</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 모든 ROIs의 계산 된 비율 값을 평균입니다.</li>
	<li>Xenobiotic (예를 들어, 첫 번째 5 번 포인트)의 추가 하기 전에 수집 이전에 계산 된 비율 값 (단계 4.4)을 평균 하 여 데이터를 정규화 하는 데 사용 됩니다 초기 계획 값을 계산 합니다.</li>
	<li>4.5에서 계산 기준 값으로 각 값을 분할 하 여 단계 4.4 비율 값을 정상화. 정규화 된 비율 값이 기준선에 1 중심, EGSH 또는 H2O2 증가 하면서 다음 주사 증가 비율을 발생 합니다. 산화 변화 유도 xenobiotic의 평가 3-6 회 기준 값의 범위에 있는 값을 생성 해 경향이 있다.</li>
	<li>응답 시간과 실험에서 비교에 투입, 100%로 제어 산화 제 (예: 1 m m H2O2)에 대 한 응답을 정의 하 여 정규화 된 데이터 최대 센서 응답의 표현. 참고: 최대 센서 응답의 데이터를 표현 하는 경우 그것은 중요 제어 산화의 동일한 농도 실험에 걸쳐 일관 되 게 사용 되도록. 라이브 셀 이미징 분석에서 파생 된 모든 데이터는 기존의 쌍 단위 및 group-wise 통계 분석 조사 관의 판단에 따라 선택 될 의무가.</li>
</ol>

이 문서에서 설명 하는 연구는 국민 건강 및 환경 효과 연구 실험실, 미국 환경 보호국, 검토 하 고 게시에 대 한 승인. 이 문서의 내용을 나타내는 기관 정책, 해석 안도 않습니다 상표명 또는 상용 제품의 언급 구성 승인 또는 사용을 위해 추천.

세포내 전자GSH 및 H2O2에 각각, 변화를 감지에 roGFP2 및 하이퍼 사용 이전 생리 및 독성 연구 25,35,36에에서 잘 설명 되었습니다. ,39,40,41,,4243. 여기에 설명 된 프로토콜 세포...

용어는 "산화 스트레스" 자주 인용 독성, 메커니즘으로 아직 거의 구체적으로 설명 하는이 용어가입니다. 산화 스트레스 반응성 산소 종, 자유 래 디 칼, 항 산화 분자의 산화에의 한 피해의 세대를 포함 하 여 여러 가지 세포내 프로세스를 참조할 수 있습니다 그리고 심지어 특정 시그널링의 활성화 폭포. 다양 한 환경 오염 물질1,2 , 제약 에이전트3,4 5 xenobiotic 화합물 자체의 어느 직접 행동에 의해 산화 스트레스를 유발 하 문서화 되었습니다. 6 또는 이차 세포 응답7,8,,910의 일환으로 산화 종의 생산. 그것은 그러므로 정확 하 게 관찰 하 고 불리 한 결과에 지도 하는 산화 과정을 특성화 독성에 큰 관심의. 산화 스트레스 측정의 종래의 방법 포함 산화 쓰이므로11,12,13,,1415 또는 산화 방지 제16의 식별 ,17,18,,1920또는 스스로21,,2223, 반응 종 직접 측정 24. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 자주 사용 샘플, 공간 해상도 제거 하 고 잠재적으로 소개 하는 유물25는 세포 장애, 필요 합니다. 산화 제 종류의 검출 및 산화 긴장의 표시에 대 한 더 과민 하 고 특정 메서드의 개발 xenobiotic 노출의 부작용의 조사에 광범위 하 게 적용 됩니다.
라이브 셀 현미경 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서의 새로운 세대를 사용 하 여 살아있는 세포의 세포내 산화 환 원 상태를 모니터링 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 이 센서는 일반적으로 바이러스 성 발기인 transfection 또는 변환 방법론을 통해 도입의 통제 벡터를 사용 하 여 표현 됩니다. 이후 세포 형광 센서 표현 확인 될 수 있다 쉽게 시각적으로 높은 식 효율성 필요 하지 않습니다. 독성 학적 평가 대 한 이러한 센서를 표현 하는 세포로 그들은 실시간으로 xenobiotic 화합물에 노출 되는 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 수 있다. 이 실험 설계 반복된 측정 동일한 셀에 각 셀의 설립된 기준 자체 컨트롤 역할을 수 있도록 허용 합니다. 라이브 셀 이미징 업체 높은 시간 해상도 겸손 한 크기 또는 자연에 과도에 특히 그 산화 이벤트의 검출에 적합. 그들의 표적 분자에 과민 하 고 특정 되 고, 뿐만 아니라 이러한 센서 들의 형광 빛의 두 파장을 사용 하 여 흥분 수 있습니다. 이 현상을 수 정통 센서 응답 인공 센서 식, 셀 두께, 램프에 변화 등으로 인 한 그와 관련 된 신호 변경의 분별을 허용 하는 비율으로 표현 될 형광 방출 강도, photobleaching, 고26형광 검출기 감도. Fluorogenic 센서의 사용의 또 다른 장점은 그들은 공간 해상도 기존의 방법25,,2627여 일치의 수준을 만드는 특정 세포 구획을 타겟팅 할 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)에 따라 유전자 인코딩 센서의 큰 가족 개발 되 고 생리 마커, ATP/ADP 비율25, 칼슘 농도, 온도, pH 등의 광범위 한 다양 한 보고서를 특징 ,,2829,,3031. 이 중 티 산화 환 원 잠재력 (EGSH)와 과산화 수소 (H2O2)의 센서는 있습니다. 이러한 센서는 산화 환 원 생물학 및 생리학에 응용 프로그램에 대 한 개발 되었다, 그러나 그들은 또한 xenobiotic 유발 산화 스트레스 공부에 적응 했습니다. 특히, 여기에 설명 된 프로토콜 EGSH 센서 roGFP2 및 H2O2 센서 하이퍼의 사용을 설명 합니다.
roGFP2는 세포내 감소와 산화 glutathione의 (GSH/GSSG) 티 과산화 효소 (메타), glutaredoxin (Grx)과 티 reductase redox 릴레이 통해 산화 환 원 잠재력에 보고 (GR) (그림 1)25, 32 , 33. 티 주된 세포 항 산화 분자 이며 cytosol25,34millimolar 농도에서 그것의 감소 된 모양 (GSH)에 주로 존재 하는. EGSH 하지 어떤 기능 결과에 연결 되어있다, 하는 동안 세포내 산화 상태34의 중요 한 지표로 인식 된다. GSSG의 농도에서 상대적으로 작은 증가 roGFP2에 의해 감지 되는 EGSH 증가 발생 합니다. 똑같이 중요 한, EGSH 의 모니터링 xenobiotic 노출 동안 roGFP2를 사용 하 여 수 잠재적으로 redox 릴레이에 여러 지점에서 행동의 메커니즘에 대해 많이 고 공개 pentose 인산 염 등 관련된 경로 션트 (그림 1 )35. 여기 두 번째 센서, 하이퍼는 세균 H2O2의 규제 도메인에 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 삽입에서 파생 된 세포내 H2O2 조사-중요 한 전사 OxyR136요소. H2O2 생리 조건37, 에서 중요 한 세포내 신호 분자로 점점 인식 되 고는 이전 되었습니다 간주 됩니다 손상 반응 산소 중간, 비록 38, H2O2 에 대 한 인식할 수 없는 역할 뿐만 아니라 독극물에 존재 하는 것을 건의. 예를 들어, 초과 H2O2 xenobiotic 노출에 의해 유도 된 세포질 신호 또는 생체 변화에 dysregulation 전조 수 있습니다.
두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 여러 설립된 셀 라인, 인간의 해 암 세포 선 A431 등 인간 기관지 상피 세포 선 BEAS-2B, EGSH 및 H2에서 변화를 관찰 하에 표현 O2 다양 한 독성 노출에 대 한 응답에서. 가스 오염 물질 (오존35), 미 립 자 물질 (1, 2 naphthoquinone39,40 와 아연41), 그리고 니켈 나노 입자 (되지 않은 데이터)의 수용 성 구성 요소 포함 됩니다. 이러한 연구는 이러한 두 센서의 가능한 응용 프로그램의 작은 하위 집합만을 나타냅니다. 이론적으로, 수신 하 고 기존의 분자 생물학 기법을 통해 이러한 센서의 DNA를 표현 할 수 있는 모든 세포 유형 xenobiotics 세포 산화 상태를 변경 하는 의심의 효과 평가 하기 위해 활용할 수 있습니다. 날짜 하려면, 하나 이상의 이러한 센서의 다양 한 원핵생물과 진핵생물, 등 여러 포유류, 식물, 박테리아, 효 모 세포 종류25,26,,3642표현 되었습니다. EGSH 및 H2O2 센서에 대 한 판독은 510에서 방출 하는 형광의 강도에 변화 nm 404 488 nm 빛과 여기에. 이 메서드는 fluorometric 플랫폼, 다양 한 종류의 현미경 (confocal 및 넓은 필드)와 판 독자를 포함 하 여 널리 적응. 여기에 제시 된 방법은 체 외에서 독성 시스템에 O2 세포내 전자GSH 및 H2의 민감하고 구체적인 관찰에 대 한 있습니다.

<table><tbody><tr><td>roGFP2 Plasmid</td><td>University of Oregon</td><td>N/A</td><td>Generous gift of S.J. Remington</td></tr><tr><td>HyPer Plasmid</td><td>Evrogen</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>9,10-Phenanthrenequinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156507</td><td></td></tr><tr><td>Black Wall Glass Bottomed Dishes</td><td>Ted Pella</td><td>14029-20</td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>192151</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Excel&amp;nbsp;</td><td>Microsoft Office Suite</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR Imaging Software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1si Confocal Imaging System</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging approaches to assessments of toxicological oxidative stress using genetically-encoded fluorogenic sensors

산화 스트레스는 일반적으로 인용된 독물학 메커니즘, 공부를 기존의 방법 샘플, 잠재적인 유물의 소개와는 반응에 대 한 특이성의 부족의 파괴를 포함 하 여 결점의 수에서 고통 받는 종 관련된입니다. 따라서, 비-파괴, 민감한, 그리고 특정 방법 관찰 하 고 계량 세포내 산화 환 원 섭, 더 일반적으로 산화 스트레스 라고 하는 데 사용할 수에 대 한 독성의 분야에서 현재 필요가 하다. 여기, 우리는 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서, roGFP2 및 하이퍼 xenobiotic 유발 산화 응답 관찰 라이브 셀 이미징 연구에 사용할 수를 사용 하는 방법을 제시. roGFP2 하이퍼 동안 티 redox 잠재적인 (EGSH)와 함께 equilibrates 과산화 수소 (H2O2)를 직접 감지. 두 센서 transfection 또는 변환을 통해 다양 한 세포 유형으로 표현 될 수 있다 그리고 특정 세포 구획을 대상 수 있습니다. 가장 중요 한 것은, 라이브 셀 현미경이이 센서를 사용 하 여 기존의 방법을 사용 하 여 가능 하지 않은 높은 공간 및 시간 해상도 제공 합니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 404에 의해 순차적으로 흥분 때 판독으로 510 nm 역할에서 모니터링 하는 형광 강도 변화 nm, 488 nm 빛. 이 속성은 두 센서 비율, 일반적인 현미경 아티팩트를 제거 하 고 센서 식 셀 사이의 차이 대 한 수정. 이 방법론 confocal 이미징 시스템, 기존의 와이드 필드 현미경 검사 법, 그리고 접시와 함께 사용을 위해 적당 한 만드는 소정의 파장에 흥분 하 고 수집 방출의 fluorometric 플랫폼의 다양 한 적용 독자입니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 세포 EGSH 및 H2O2 세대 실시간으로 모니터링 하 다양 한 세포 유형 및 독물학 연구에에서 사용 되었습니다. 여기에 설명 된 세포 유형 및 산화 스트레스의 라이브 세포 독성 평가에 roGFP2 및 하이퍼의 응용 프로그램에 대 한 fluorometric 플랫폼에 걸쳐 널리 적응력은 표준화 된 방법이입니다.

EGSH 및 세포내 H2O2 에서 변화를 감지에 roGFP2 및 하이퍼 사용 잘 했습니다25,36,,4243 위에서 설명한 고 여기 설명 된다. 기준선 및 다음의 추가 H2O2 와 DTT에 roGFP2을 표현 하는 셀의 공초점 이미지는 그림 2에 표시 됩니...

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

imaging-approaches-to-assessments-toxicological-oxidative-stress

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.4K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. 이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

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Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. Thiols are especially important for illuminating the redox status of cells via their reduced dithiol and oxidized disulfide ratios. Engineered cysteine-containing fluorescent proteins open a new era for redox-sensitive biosensors. One of them, redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP), can easily be introduced into cells with adenoviral transduction, allowing the redox status of subcellular compartments to be evaluated without disrupting cellular processes. Reduced cysteines and oxidized cystines of roGFP have excitation maxima at 488 nm and 405 nm, respectively, with emission at 525 nm. Assessing the ratios of these reduced and oxidized forms allows the convenient calculation of redox balance within the cell. In this method article, immortalized human triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231) were used to assess redox status within the living cell. The protocol steps include MDA-MB-231 cell line transduction with adenovirus to express cytosolic roGFP, treatment with H2O2, and assessment of cysteine and cystine ratio with both flow cytometry and fluorescence microscopy.

This protocol describes the assessment of subcellular compartment-specific redox status within the cell. A redox-sensitive fluorescent probe allows convenient ratiometric analysis in intact cells.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

연구

생화학

간암 세포에서 Dihydroethidium을 사용한 새로운 ROS 정량 분석

High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS production plays a central role in the spatial and temporal modulation of normal cellular functions such as proliferation, signaling, apoptosis, and senescence. In contrast, chronic ROS overproduction is responsible for a wide spectrum of diseases, such as cancer, cardiovascular disease, and diabetes, among others. Quantifying ROS levels in an accurate and reproducible manner is thus essential to understanding normal cellular functionality. Fluorescence imaging-based methods to characterize intra-cellular ROS species is a common approach. Many of the imaging ROS protocols in the literature use 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) dye. However, this dye suffers from significant limitations in its usage and interpretability. The current protocol demonstrates the use of a dihydroethidium (DHE) fluorescent probe as an alternative method to quantify total ROS production in a high-throughput setting. The high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, was used to measure and quantify the ROS production. This study was conducted in three hepatocellular cancer cell lines - HepG2, JHH4, and HUH-7. This protocol provides an in-depth description of the various procedures involved in the assessment of ROS within the cells, including - preparation of DHE solution, incubation of cells with DHE solution, and measurement of DHE intensity necessary to characterize the ROS production. This protocol demonstrates that DHE fluorescent dye is a robust and reproducible choice to characterize intracellular ROS production in a high-throughput manner. High throughput approaches to measure ROS production are likely to be helpful in a variety of studies, such as toxicology, drug screening, and cancer biology.

저자 스포트라이트: 간세포주에서 세포 내 ROS 수준의 고처리량 측정

This protocol describes a novel method to quantify intracellular reactive oxygen species (ROS) using dihydroethidium (DHE) as a fluorescence dye probe using a high-throughput screening approach. The protocol describes the methods for quantitative assessment of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the three different hepatocellular carcinoma cell lines.

Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS ...

생체공학

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

생물학

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

신경과학

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the modification of proteins, lipids, and DNA, which finally may lead to alteration in cellular function and cell death. Therefore, it is beneficial for cells to increase their antioxidant defense in response to detrimental insults, either by activating an antioxidant pathway like Keap1/Nrf2 or by improving redox scavengers (vitamins A, C, and E, &#946;-carotene, and polyphenols, among others). Inflammation and oxidative stress are involved in the pathogenesis and progression of retinopathies, such as diabetic retinopathy (DR) and retinopathy of prematurity (ROP). Since M&#252;ller glial cells (MGCs) play a key role in the homeostasis of neural retinal tissue, they are considered an ideal model to study these cellular protective mechanisms. In this sense, quantifying ROS levels with a reproducible and simple method is essential to assess the contribution of pathways or molecules that participate in the antioxidant cell defense mechanism. In this article, we provide a complete description of the procedures required for the measurement of ROS with DCFH-DA probe and flow cytometry in MGCs. Key steps for flow cytometry data processing with the software are provided here, so the readers will be able to measure ROS levels (geometric means of FITC) and analyze fluorescence histograms. These tools are highly helpful to evaluate not only the increase in ROS after a cellular insult but also to study the antioxidant effect of certain molecules that can provide a protective effect on the cells.

Here, we propose a systematized, accessible, and reproducible protocol to detect cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in M&#252;ller glial cells (MGCs). This method quantifies total cellular ROS levels with a flow cytometer. This protocol is very easy to use, suitable, and reproducible.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

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반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석