여기서 우리는 적응형 실험실-온-칩 플랫폼 내에서 뼈 세포를 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 기술은 기계적으로 유도된 뼈 리모델링을 조절하는 메커니즘에 대한 이해를 높이기 위해 사용될 수 있습니다. 우리의 시스템은 변경 된 기계적 적재 환경에 대한 응답으로 뼈 형성 및 재흡수의 직접 적인 정량화를 가능하게 뼈 세포의 장기 배양을 할 수 있습니다.
이러한 기초 기술의 사용은 골다공증, 골절 치유 및 periprosthetic 골다정산과 같은 뼈 관련 문제의 수로 확장 발견으로 이어질 수 있습니다. 웰 및 마이크로채널 층을 만들려면 PDMS 프리폴리머 및 경화제를 플라스틱 컵에 10대 1의 비율로 결합하고 격렬하게 혼합한 다음 30분 동안 폴리머를 탈가스로 드시면 됩니다. 적절한 사전 레벨 마스크 위에 혼합물을 천천히 붓습니다.
30분 동안 앉아서 섭씨 45도에서 18시간 동안 굽습니다. 테이퍼 된 실험실 주걱으로 PDMS의 가장자리를 느슨하게하고 조심스럽게 마스크에서 벗겨 낸 다음 메스와 3D 인쇄 템플릿으로 개별 칩을 잘라 서 포장 테이프로 표면 청소하십시오. PDMS 멤브레인 층을 만들려면 PDMS를 혼합, 붓기 및 베이킹하기 위한 이전 단계를 반복합니다.
레벨링 상자에서 PDMS 시트를 제거하고 웰 및 마이크로 채널 레이어의 치수와 일치하는 개별 멤브레인을 잘라냅니다. 캘리퍼를 사용하여 중앙의 멤브레인 두께를 측정하고 원하는 두께 를 벗어난 멤브레인을 폐기한 다음 포장 테이프로 멤브레인을 조심스럽게 청소하고 파라핀 필름에 놓습니다. PDMS 뚜껑 레이어를 만들려면 PDMS를 혼합, 붓기 및 베이킹하기 위한 이전 단계를 반복합니다.
개별 뚜껑을 크기로 절단한 후 1mm 생검 펀치로 PDMS를 통해 구멍을 뚫고 포장 테이프로 표면을 청소하십시오. 중간 무선 주파수 전원 설정에서 플라즈마 클리너로 1층과 2층의 표면을 활성화한 다음 레이어 1의 액세스 구멍을 2층의 마이크로채널과 정렬하고 두 레이어를 함께 단단히 누릅니다. 딥웰 설계를 위해, 플라즈마 처리 중에 3층의 파라핀 필름을 평평한 표면에 부착하기 위해 양면 테이프를 사용하여 2층과 3층으로 이 과정을 반복하십시오.
PDMS 멤브레인에서 여분의 재료를 잘라 조심스럽게 칩의 바닥에서 파라핀 필름의 시트를 벗겨. 칩을 섭씨 65도에서 10분간 구워 PDMS 층 간의 결합 강도를 늘린 다음, 각 분배 팁을 뚜껑의 액세스 구멍에 삽입하고 마이크로 파이프 팁을 사용하여 2부 에폭시로 고정하여 각 팁 주위에 에폭시를 적용합니다. 에폭시가 완전히 경화된 후, 표면은 70%에탄올로 칩을 청소하고 생물안전 캐비닛으로 옮기습니다.
멸균 실리콘 튜브와 디스펜싱 팁에 5 밀리리터 주사기를 연결하고 적어도 30 초 동안 70 %에탄올로 전체 칩을 채웁니다. 칩에서 에탄올을 제거하고 하룻밤 동안 UV 빛으로 살균하십시오. 다음 날, 증류수로 칩을 세 번 씻고 물로 채우고 분배 팁에서 튜브를 제거합니다.
칩을 섭씨 37도에서 최소 48시간 동안 배양합니다. 압축 스프링을 플레이트 의 샤프트 주위에 놓고 베이스 하단의 중앙 구멍에 삽입 한 다음 다이얼 블록을 4 개의 셀프 태핑 나사로 베이스 바닥에 부착합니다. 중앙 나사 주위에 두 번째 압축 스프링을 놓습니다.
나사를 다이얼 하단의 육각형 모양의 구멍에 삽입하고 어셈블리를 다이얼 블록 중앙의 나사 구멍에 나사로 연결합니다. 4명의 남성-암컷 스탠드오프를 기지 바닥에 나사로 넣습니다. 플레이트 의 상단이 베이스의 상단 아래에 될 때까지 반시계 방향으로 다이얼을 돌려 장치에서 여유를 제거한 다음, 플레이트의 상단이 베이스의 상단과 레벨이 될 때까지 천천히 다이얼을 시계 방향으로 돌립니다.
5 밀리리터 주사기를 사용하여 깊은 칩에서 물을 제거하고 아세트산에 I 콜라겐 유형 의 200 마이크로 리터로 우물의 바닥을 코팅한 후 한 시간 동안. 칼슘과 마그네슘으로 DPBS를 사용하여 칩을 세 번 헹구고 칩 홀더에 넣습니다. 종아리 혈청, FBS 및 페니실린/연쇄절제술로 보충된 MEM 알파 배지에서 MLO-Y4 골다세포로 칩을 시드합니다.
디스펜싱 팁에서 튜브를 제거하고 칩을 깊은 문화 요리에 넣고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 72시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 멸균 튜브를 사용하여 팁을 분배하고 5 밀리리터 주사기를 사용하여 칩에서 소비된 배양 매체를 제거한 다음 칩을 신선한 배지로 천천히 리필합니다. 칩 홀더를 로딩 장치 베이스 상단의 직사각형 인셋에 넣고 뚜껑에 있는 슬롯을 통해 튜브를 공급하고 뚜껑을 베이스로 고정합니다.
원하는 도금 변위가 도달 할 때까지 다이얼을 시계 방향으로 돌려 셀에 부하를 적용 한 다음 로드 장치를 빈 P1000 마이크로 파이펫 팁 상자에 넣고 15 분 동안 부하로 셀을 배양합니다. 인큐베이션 후 다이얼을 시계 반대 방향으로 원래 의 시작 위치로 전환하여 셀에서 하중을 제거한 다음 장치에서 뚜껑을 제거하고 칩 홀더를 딥 웰 배양 판에 배치하고 90분 동안 셀을 배양합니다. 칩에서 조건부 배지를 제거하고 칩 홀더에서 칩을 제거하기 위해 5 밀리리터 주사기를 사용한 다음 테이퍼 주걱을 사용하여 PDMS 뚜껑과 잘 층 사이의 결합을 끊습니다.
이제 셀을 분석할 준비가 되었습니다. 얕은 우물 구성은 골세포 및 골세포의 기능적 활동을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 프리오스테오스트로부터의 뼈 형성은 알리자린 레드와 폰 코사 얼룩을 사용하여 정량화하였다.
골세포에서 뼈 흡수는 흡수 구덩이의 존재를 확인하기 위해 툴루이딘 블루 염색 및 스캐닝 전자 현미경 검사를 사용하여 정량화되었다. 딥웰 칩 구성은 비행기 팽창에서 정적을 통해 세포를 스트레칭하여 골세포 메카노트랜스듀션을 유도하는 데 사용되었습니다. 칩에 시드된 골세포의 이미지는 증류수를 가진 칩의 48시간 배큐어가 일반적인 형태학에서 세포 생존가능성을 유지하는 데 중요하다는 것을 보여줍니다.
로딩의 시합 동안, 골세포는 PDMS 멤브레인에 유도된 균주 그라데이션에 노출되었다. 1밀리미터와 2밀리미터 사이의 값에 대한 평균 동등한 균주와 도금 변위 사이의 관계가 결정되었고 유도된 균주의 대표적인 열맵이 생성되었다. 하중 후, 세포 생존가능성은 락테이트 탈수소효소 염색및 부속서 V 및 죽은 세포 분석으로 분석되었다.
스트레치 탈수소 효소 얼룩의 스트레치 탈수소 염분은 더 높은 스트레인 값의 위치에 해당하는 우물의 외부 가장자리 근처에서 가벼운 염색을 보였다. 우리의 플랫폼은 다재다능함의 높은 수준을 제공하고 부하 유도 메카노 트랜스듀션, 염증 및 약물 효과와 같은 뼈 리모델링을 조절하는 다양한 요인을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 기술은 뼈 건강을 통제하는 다세포 복잡성의 우리의 이해를 크게 향상시킬 수 있는 칩에 진정한 뼈 기관을 개발하기 위한 기초를 제공합니다.
