用于刺激骨质复变和分析骨骼重塑功能结果的实验室A芯片平台

在这里，我们提出了在一个可适应的芯片实验室平台中培养骨细胞的协议。这些技术可用于加深我们对机械诱导骨重塑机制的理解。我们的系统允许骨细胞的长期培养，从而能够直接量化骨骼的形成和吸收，以应对机械载荷环境的变化。

使用这些基础技术可导致发现，这些发现延伸到一些与骨骼相关的问题，如骨质疏松症、骨折愈合和骨质疏松。为了创建井和微通道层，将PDMS预聚合物和固化剂以10比1的比例在塑料杯中混合，并大力混合，然后对聚合物进行30分钟的脱气。慢慢地将混合物倒在适当的预平面膜上。

让它坐 30 分钟，在 45 摄氏度下烘烤 18 小时。用锥形实验室铲松开 PDMS 的边缘，小心地从面罩上剥离，然后用手术刀和 3D 打印模板切出单个芯片，然后用包装胶带表面清洁它们。要制作 PDMS 膜层，请重复前面的步骤进行混合、浇注和烘烤 PDMS。

从平平盒中取出 PDMS 板材，并切割与井和微通道层尺寸相匹配的单个膜。使用卡钳测量中心的膜厚度，并丢弃任何超出所需厚度的膜，然后用包装胶带仔细清洁膜，并把它们放在一块石蜡薄膜上。要制作 PDMS 盖层，请重复前面的步骤进行混合、浇注和烘烤 PDMS。

切割单个盖子大小后，用一毫米活检冲孔打孔穿过 PDMS，然后用包装胶带表面清洁。在中等无线电频率功率设置上，使用等离子清洁剂激活第一层和二层的表面 30 秒，然后将第 1 层的接入孔与第二层的微通道对齐，并牢固地将两层压在一起。对于深井设计，在等离子体处理期间，使用双面胶带将第三层的石蜡膜连接到平面上，重复此过程。

从 PDMS 膜中修剪掉多余的材料，然后小心地从芯片底部剥离石蜡膜片。在 65 摄氏度下烘烤芯片 10 分钟，以增加 PDMS 层之间的粘结强度，然后将角度点胶尖端插入盖子上的访问孔，并使用微管尖端用两部分环氧树脂固定它们，以在每个尖端周围涂抹环氧树脂。环氧树脂完全固化后，用70%乙醇表面清洁芯片，并转移到生物安全柜。

用无菌硅胶管将五毫升注射器连接到点胶尖端，用 70%乙醇填充整个芯片至少 30 秒。从芯片上去除乙醇，并在一夜之间用紫外线消毒。第二天，用蒸馏水清洗碎屑三次，加注水，然后从点胶尖上取下油管。

在37摄氏度下孵育芯片至少48小时。在板子轴周围放置一个压缩弹簧，并将其插入底座底部的中心孔中，然后用四个自攻螺钉将表盘块连接到底座底部。在中央螺钉周围放置第二个压缩弹簧。

将螺钉插入表盘底部的六角形孔中，并将组件拧入表盘块中心的螺纹孔中。将四个男女对峙拧入底座底部。通过逆时针转动表盘，直到板的顶部低于底座顶部，然后顺时针缓慢转动表盘，直到板的顶部与底座顶部平起平分。

使用五毫升注射器从深井芯片中去除水，并在井底涂上200微升的一级醋酸胶原蛋白，一小时。使用 DPBS 用钙和镁冲洗芯片三次，然后放入芯片支架中。在 MEM alpha 介质中用 MLO-Y4 骨细胞播种芯片，并辅以小牛血清、FBS 和青霉素/链霉素。

从点胶尖端取出管子，将芯片放入深井培养皿中，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞72小时。孵育后，将无菌管连接到点胶上，并使用五毫升注射器从芯片上取出用过的培养介质，然后用新鲜介质慢慢重新填充芯片。将芯片支架放入装载设备底座顶部的矩形内嵌中，通过盖上的插槽馈送管子，然后将盖子固定到底座上。

通过顺时针转动表盘将负载施加到电池中，直到达到所需的板位位，然后将装载装置放入空的 P1000 微移头盒中，然后用负载孵化电池 15 分钟。孵育后，逆时针将表盘转动到原始起始位置，从细胞中取出负载，然后从设备上取下盖子，将芯片支架放入深井培养板中，并在负载恢复后孵育细胞90分钟。使用五毫升注射器从芯片中取出调节介质，然后从芯片支架上取出芯片，然后使用锥形铲来打破 PDMS 盖和井层之间的粘结。

单元格现在可以进行分析了。浅井配置可用于分析成骨细胞和骨细胞的功能活动。前细胞的骨骼形成使用阿里扎林红和冯科萨污渍进行量化。

骨质疏松的骨吸收是使用托卢伊丁蓝色染色进行量化的，并采用扫描电子显微镜来验证吸收坑的存在。深井芯片配置用于通过平面扩张的静态拉伸细胞来诱导骨细胞机械转移。芯片中种子的骨细胞图像表明，用蒸馏水孵育芯片48小时对于保持典型形态中的细胞生存能力至关重要。

在加载过程中，骨细胞暴露在PDMS膜上诱导的应变梯度下。确定了一至两毫米值的平均等效应变与板位移的关系，并生成了诱导应变的代表性热图。加载后，用乳酸脱氢酶染色和附物V和死细胞测定分析细胞活性。

拉伸骨细胞的乳酸脱氢酶染色在井外边缘附近出现较浅的染色，与较高应变值的位置相对应。我们的平台提供高度的多功能性，可用于研究调节骨骼重塑的各种因素，如负载引起的机械转移、炎症和药物效应。这里介绍的技术为在芯片上开发真正的骨器官提供了基础，可以极大地增进我们对调节骨骼健康的多细胞复杂性的理解。