이 프로토콜을 사용하여, 세포 이동 및 침략은 유전자 기능 및 약물의 손실 또는 이득하에서 세포 역학을 가능하게 하는 실시간 조건하에서 드러나질 수 있다. 다른 방법과 는 달리 염색, 기계적 세포 손상 또는 형광 마커가 필요하지 않습니다. 가장 중요한 것은, 실시간 세포 운동학은 효과적인 방식으로 결정될 수 있다.
U-118MG 세포주 배양이 70~80%에 도달하면 PBS로 세포를 세척한 후 0.5%의 트립신-EDTA의 2밀리리터로 세포를 치료한다. 섭씨 37도에서 30초 후, 신선한 배양 배지의 10 밀리리터로 반응을 멈추고 분리된 세포를 15밀리리터 원컬튜브로 옮춥시다. 계산 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 신선한 배지의 적절한 부피에서 조건 농도당 6회 10에서 다섯 번째 세포로 펠릿을 재연한다.
조건당 1개의 미세원심분리기 튜브로 6번 10번 을 옮기고 각 튜브에 덜벡코의 PBS의 800마이크로리터를 추가한다. 원심 분리 후, 각 펠릿을 60 마이크로리터의 재서스펜션 버퍼 R 및 관심 있는 siRNA의 6마이크로몰라로 재보종. 각 튜브를 부드러운 태핑과 혼합한 후 각 셀 서스펜션의 10마이크로리터 알리쿼트10개를 10밀리초 1, 350볼트 펄스로 감식합니다.
각 치료 후, 신선한 배양 배지의 개별 5 밀리리터 알리쿼트에서 각 조건에서 전극 된 세포를 풀. 그런 다음 조건당 2개의 35 밀리미터 배양 접시로 세포를 시드하고 3 일 동안 세포 배양 배양 배양에 세포를 놓습니다. 실시간 세포 분석 5~6시간 전에 실시간 세포 분석 시스템을 세포 배양 인큐베이터에 배치합니다.
침입 분석서를 설정하려면 역파이프를 사용하여 세포 외 매트릭스 젤의 밀리리터 당 0.1 마이크로그램으로 보충된 DMEM의 50 마이크로리터를 세포 침입 플레이트의 상부 챔버의 각 우물에 배치하십시오. 도금 직후, 각 우물에서 세포외 매트릭스 용액의 30 마이크로리터를 제거하고 4 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 임피던스 측정 프로그램을 설정하려면, 측정 6시간 전에, 모든 전극형 세포 배양에서 저혈재 배지로 배지를 교체한다.
관련 임피던스 측정 소프트웨어의 레이아웃 탭에서 각 생물학적 상태에 대해 4배로 웰을 선택합니다. 일정 탭에서 1분 간격으로 일회성 기준측정 스윕 단계를 설정하고 실제 실험을 위해 각각의 개별 요람에서 셀 임피던스를 측정하는 두 번째 단계를 설정합니다. 세포 임피던스 측정이 시작되기 1시간 전에, 세포 침범 및 이주 판의 하부 챔버의 우물에 화학요법제로 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 160마이크로리터를 첨가한다.
침략을 측정하기 위해 세포외 매트릭스 젤 코팅 우물을 포함하는 상부 챔버를 조립하십시오. 마이그레이션을 측정하려면 상부 챔버에서 코팅되지 않은 우물을 사용합니다. 두 가지 유형의 실험의 경우, 상부 챔버의 우물을 50 마이크로리터의 낮은 혈청 배지로 채우고 챔버를 시스템의 요람에 놓습니다.
소프트웨어의 메시지 탭을 클릭하여 모든 우물이 제어 장치에서 인식되는지 여부를 확인합니다. 메시지가 예상대로 표시되면 요람의 플레이트가 실험에 대한 준비가 되었습니다. 그런 다음 완전히 포장된 플레이트를 세포 배양 조건에 적응하기 위해 1시간 동안 실시간 세포 분석 시스템 요람에 세포 배양 배양배소에 배치한다.
플레이트가 평형되는 동안, 각 조건에서 8회 10회에서 낮은 혈청 중간 농도의 800 마이크로리터 당 다섯 번째 세포로 세포를 재보습하는 것으로 진보세포종을 수확한다. 또한, 하류 서양 얼룩 분석을 위한 35밀리미터 접시에 파종하기 위한 배양 배지의 2밀리리터에 5번째 세포에 3번 10번 을 따로 둡니다. 기준선 사전 마이그레이션 판독값을 측정하려면 적응이 끝나면 요람 시작 단추를 클릭합니다.
기준선 측정을 획득한 후, 각 요람에서 이주 및 침략 판을 생물 안전 캐비닛으로 옮길 수 있습니다. 역피 피펫 100 마이크로리터는 요람의 제어 부에 프로그래밍된 바와 같이 세포 침입 및 이주 플레이트의 적절한 우물에서 각 생물학적 상태에 대해 상층실 우물을 네 배로 배반한다. 시드 후, 실온에서 30분 동안 생체 안전 캐비닛에 플레이트를 보관하여 각 요람으로 플레이트를 옮기기 전에 플레이트 바닥에 균등하게 정착할 수 있도록 합니다.
요람 시작 버튼을 클릭하여 셀 임피던스 측정을 시작합니다. 실험 완료 중 또는 실험 완료 후 시간 종속 방식으로 셀 임피던스의 변화를 시각화하려면 데이터 분석 탭을 엽니다. 각 조건에 대한 데이터를 개별적으로 또는 평균 및/또는 표준 편차로 시각화하려면 평균 및 표준 편차에 대한 옵션 상자를 클릭합니다.
셀 인덱스 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내려면 데이터 분석 창 중간에 커서를 배치하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다. 표시되는 대화 상자에서 복사 데이터를 목록 형식 옵션으로 선택하고 데이터를 열린 스프레드시트에 붙여 넣습니다. 실험을 해제하려면 각 요람의 릴리스 단추를 클릭합니다.
Crk 어댑터 단백질 녹다운은 Crk1 및 Crk2 단백질 수치를 Crk와 같은 단백질 수준을 유도하지 않고 각각 85%와 86%씩 감소합니다. Crk와 같은 녹다운은 Crk1 및 Crk2 단백질 수치가 약간 감소하여 Crk와 같은 단백질 발현을 85% 감소시킵니다. 두 siRNA를 결합하면 Crk1, Crk2 및 Crk와 같은 표현을 80% 이상 감소시키며, 빈쿨린이나 알파-투굴린 발현은 Crk 또는 Crk와 같은 넉다운의 조합에 의해 영향을 받지 않습니다.
인간의 뇌 교모세포종 세포는 13 시간에서 이동의 최대 수준에 도달 높은 혈청 농도에 대한 응답으로 그라데이션을 따라 마이그레이션. Crk 녹다운 셀에서는 마이그레이션이 처음에는 지연되었지만 세포는 23시간까지 계속 마이그레이션되었습니다. Crk 와 같은 녹다운은 교모세포종 세포주가 암 세포 이동에서 Crk와 Crk와 같은 중요한 중첩 역할을 한다는 것을 제안하는 Crk와 Crk와 같은 두 가지 의 낙폭 시 철새 능력을 완전히 잃어감이면 세포 이동을 실질적으로 감소시킵니다.
그러나, 세포 침략이 며칠 동안 감시될 때, Crk knockdown 세포는 Crk 와 같은 세포가 부분적으로 침략능력을 90시간까지 회복하고 40시간 후에 침략하는 감소된 능력을 보여주는 이중 Crk-Crk 세포와 60시간에서 교모세포종 세포를 통제하는 것과 비교되는 유사한 최대 세포 침략 수준에 도달합니다. 결과는 명확하게 세포 침략이 실험의 전체 기간 동안 분석되어야 한다는 제안을 지원합니다. 침략 분석 및 종자 세포에 대한 세포 외 매트릭스를 기록하는 동안 세포의 오른쪽 수를 시드하고 기포를 피하는 것은이 실험의 성공을위한 핵심 포인트입니다.
유사한 절차에 따라 그러나 전자 플레이트를 사용하여, 세포 접착 및 세포 증식 운동학은 결정될 수 있습니다.
