Usando este protocolo, la migración celular y la invasión pueden ser reveladas bajo condiciones en tiempo real permitiendo determinar la cinética celular bajo pérdida o ganancia de la función genética y los medicamentos. A diferencia de otros métodos, no se necesitan manchas, daños mecánicos en las células ni marcadores fluorescentes. Lo más importante es que la cinética celular en tiempo real se puede determinar de manera eficaz.
Cuando el cultivo de la línea celular U-118MG alcance entre el 70 y el 80% de confluencia, lave las células con PBS antes de tratar las células con dos mililitros de 0,5% de tripsina-EDTA. Después de 30 segundos a 37 grados celsius, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de cultivo fresco y transfiera las células separadas a un tubo cónico de 15 mililitros. Después del conteo, recoger las células por centrifugación y resuspender el pellet en un seis veces 10 a la quinta célula por concentración de condición en el volumen adecuado de medio fresco.
Transfiera seis veces 10 a las quintas células en un tubo de microcentrífuga por condición y agregue 800 microlitros del PBS de Dulbecco a cada tubo. Después de la centrifugación, resuspender cada pellet en 60 microlitros de tampón de resuspensión R y seis micromolares del siRNA de interés. Mezcle cada tubo con un suave roscado antes de electroporar 10 microlitros alícuotas de cada suspensión celular con tres pulsos de 10 milisegundos y 1.350 voltios.
Después de cada tratamiento, agrupar las células electroporated de cada condición en alícuotas individuales de cinco mililitros de medio de cultivo fresco. Luego sembrar las células en dos platos de cultivo de 35 milímetros por condición y colocar las células en la incubadora de cultivo celular durante tres días. Cinco a seis horas antes del análisis celular en tiempo real, coloque el sistema de análisis celular en tiempo real en la incubadora de cultivo celular.
Para establecer un ensayo de invasión, utilice pipeteo inverso para colocar 50 microlitros de DMEM suplementados con 0,1 microgramos por mililitro de gel de matriz extracelular en cada pozo de la cámara superior de una placa de invasión celular. Inmediatamente después del enchapado, retire 30 microlitros de la solución de matriz extracelular de cada pozo y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas. Para configurar un programa de medición de impedancia, seis horas antes de la medición, reemplace el medio en todos los cultivos celulares electroporados por un medio sérico bajo.
En la pestaña Diseño del software de medición de impedancia asociado, seleccione pozos cuadrúplicados para cada condición biológica. En la ficha Programación, establezca un paso de barrido de medición de línea base de una sola vez con un intervalo de un minuto y establezca un segundo paso para medir la impedancia de celda en las respectivas base individuales para el experimento real. Una hora antes del inicio de la medición de impedancia celular, añadir 160 microlitros de medio complementados con 10%suero bovino fetal como quimioatractant en los pozos de la cámara inferior de la invasión celular y placa de migración.
Para medir la invasión, ensamble la cámara superior que contiene los pozos recubiertos con gel de matriz extracelular. Para medir la migración, utilice pozos sin recubrimiento en la cámara superior. Para cualquier tipo de experimento, llene los pozos en la cámara superior con 50 microlitros de bajo medio sérico y coloque las cámaras en la base del sistema.
Haga clic en la pestaña Mensaje del software para determinar si la unidad de control reconoce todos los pozos. Si el mensaje se muestra como se esperaba, la placa de la base está lista para el experimento. A continuación, coloque las placas completamente embaladas en la incubadora de cultivo celular en la base del sistema de análisis celular en tiempo real durante una hora para aclimatar la placa a las condiciones de cultivo celular.
Mientras las placas se están equilibrando, cosecha las células del glioblastoma como se ha demostrado y resuspendir las células de cada condición a ocho veces 10 a las quintas células por cada 800 microlitros de baja concentración media sérica. Además, reserve un tres veces 10 a las quintas células en dos mililitros de medio de cultivo para la siembra en un plato de 35 milímetros para el análisis de manchas occidentales aguas abajo. Para medir la lectura de premigración de línea base, al final de la aclimatación, haga clic en el botón Inicio de la base.
Una vez adquirida la medición de línea de base, transfiera la migración y las placas de invasión de sus respectivas cunas a un gabinete de bioseguridad. Pipeta inversa 100 microlitros de células en pozos de cámara superior cuadrúplicados para cada condición biológica en el pozo apropiado de las placas de invasión y migración celular según lo programado en la unidad de control de la cuna. Después de la siembra, mantenga las placas en el gabinete de bioseguridad durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten uniformemente en el fondo de la placa antes de transferir las placas a sus respectivas cunas.
Haga clic en el botón Inicio de la base para comenzar a medir la impedancia de la celda. Para visualizar los cambios en la impedancia de celda como el índice de celda de una manera dependiente del tiempo durante o después de la finalización del experimento, abra la pestaña Análisis de datos. Para visualizar los datos de cada una de las condiciones respectivas, ya sea individualmente o como promedios y/o desviaciones estándar, haga clic en los cuadros de opción para la desviación media y estándar.
Para exportar los datos del índice de celda a un archivo de hoja de cálculo, coloque el cursor en el centro de la ventana de análisis de datos y haga clic con el botón derecho. En el cuadro de diálogo que aparece, seleccione la opción copiar datos en formato de lista y pegue los datos en una hoja de cálculo abierta. Para liberar el experimento, haga clic en el botón Liberar en cada base.
El derribo de proteínas del adaptador Crk reduce los niveles de proteína Crk1 y Crk2 en un 85% y un 86%, respectivamente, sin inducir los niveles de proteína similares a Crk. El derribo de Crk-like reduce la expresión de proteína similar a Crk en un 85%con ligeras reducciones en los niveles de proteína Crk1 y Crk2. La combinación de ambos siRNAs reduce la expresión similar a Crk1, Crk2 y Crk en más de un 80%, mientras que ni Vinculin ni la expresión alfa-Tubulina se ven afectados por ninguna combinación de Crk o Crk-like knockdown.
Las células del glioblastoma cerebral humano migran a lo largo de un gradiente en respuesta a altas concentraciones séricas que alcanzan el nivel máximo de migración a las 13 horas. En las células knockdown de Crk, aunque la migración se retrasa inicialmente, las células continuaron migrando hasta 23 horas. El derribo similar a Crk reduce sustancialmente la migración celular con la línea celular del glioblastoma perdiendo completamente su capacidad migratoria al derribar tanto a Crk como a Crk, lo que sugiere que Crk y Crk desempeñan roles de superposición esenciales en la migración de células cancerosas.
Sin embargo, cuando la invasión celular se monitorea durante varios días, las células knockdown de Crk alcanzan un nivel máximo similar de invasión celular en comparación con el control de las células del glioblastoma a las 60 horas con células similares a Crk recuperando parcialmente su capacidad invasiva en 90 horas y células Crk-Crk dobles que demuestran una capacidad reducida para invadir después de 40 horas. Los resultados apoyan claramente la sugerencia de que la invasión celular debe ser analizada durante todo el período del experimento. La siembra del número correcto de células y la evitación de las burbujas de aire mientras se registra la matriz extracelular para el ensayo de invasión y las células de siembra son puntos clave para el éxito de este experimento.
Siguiendo un procedimiento similar, pero utilizando placas electrónicas, se puede determinar la adherencia celular y la cinética de proliferación celular.
