이 프로토콜은 선천성 심장 결함을 연구하는 다른 그룹에서 더 널리 사용될 수 있도록 새로운 조직 분석 기술을 표준화합니다. 정성적 및 정량적 분석 기술이 모두 장단점을 가지고 있기 때문에 이 방법론은 두 가지 를 모두 사용하여 가장 광범위한 실험 적 질문을 해결합니다. 이 기술은 심장 진단 방법에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
예를 들면, 병리학자는 생검 견본에서 인간 적인 심장병을 진단하는 쪽으로 우리의 현미경 심장 조직 분석 기술을 적용할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 발달 심장학 또는 일반적인 심장학 연구에 사용될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 또한 임의의 조직 분석에 적용할 수 있는 다양 한 유용한 기술을 제공.
배아의 날 15~15.5개의 하트를 수집하려면 임신한 댐의 팔다리를 확보하고 요도주변에서 흉골까지 시작하여 몸통을 따라 I자형 절개를 조심스럽게 만듭니다. 스쿱 모션에 집게를 사용하여, 추출에 도움이 미세 집게와 필요에 따라 자궁의 피상 적 조직을 파악 하는 복강에서 자궁을 부드럽게 들어 올립니다. 가위를 사용하여 복부에서 자궁을 방출하십시오.
차가운 PBS에 자궁을 담근 후, 해부 접시에 오르간을 고정. 가위를 사용하여 자궁을 각각 별도의 배아를 포함하는 개별 섹션으로 자른다. 두 쌍의 미세 한 개의 포셉을 사용하여 자궁 조직에서 배아를 부드럽게 껍질을 벗기고 섭씨 4도가 함유 된 새로운 페트리 접시에 넣습니다.
심혼을 수집하기 위하여는, 해부현미경의 밑에 접시를 놓고 양상을 supine 위치에 태아를 놓기 위하여 미세 한 집게의 2 쌍을 이용합니다. 가슴에 대한 접근을 안정화한 후, 두 번째 미세 집게의 날카로운 점을 사용하여 clavicles 사이배꼽으로 확장되는 배아의 흉골을 따라 절개를 합니다. 점차적으로 가슴 구멍의 내부를 향해 작업하는 동안 매우 미세하고 피상적 인 절개를하고, 배아의 복부를 엽니 다.
심장이 막 보이면 몸통을 갈비뼈에 약간 끼워 갈비뼈가 열리도록 짜냅니다. 한 쌍의 집게의 측면을 사용하여 조직을 분리하지 않고 폐 혈관을 부드럽게 잡고 심장을 구멍에서 끌어 냅니다. 45~60분 동안 4%의 파라포름알데히드로 조직을 고정하기 전에 신선한 PBS-EDTA에서 1~2분 동안 심장을 청소하십시오.
그런 다음, 글리신으로 보충 PBS에서 세척 당 5 ~ 10 분 동안 심장을 세 번 씻습니다. 4섭씨에서 PBS에 하트를 저장하기 전에. 저온 절제를 위해 심장을 준비하려면 샘플을 섭씨 4도에서 섭씨 30 %와 PBS의 튜브에 24 ~ 40 시간 동안 배치하십시오.
하트가 튜브 의 바닥에 침몰했을 때, 각 심장을 보풀 없는 물티슈 조각으로 조심스럽게 옮기려면 변형된 팁이 있는 파스퇴르 파이펫을 사용하십시오. 짧은 공기 건조 후, 단면에 대한 원하는 방향으로 개별 최적의 절단 온도 금형에 각 샘플을 배치합니다. 기포없이 최적의 절삭 온도 매체에 조직을 잠급.
그런 다음 금형을 섭씨 20도까지 보관한 후 극저온 절제 전에 최소 24시간 동안 80°C의 조직을 동결하십시오. 시료의 극저온 부분을 얻으려면 신선한 최적의 온도 절단 매체를 사용하여 저온의 척에 관심있는 조직 블록을 부착하고 불투명한 흰색이 될 때까지 매체가 얼릴 수 있도록하십시오. 새 블레이드를 삽입하고 티슈 블록과 블레이드 사이의 거리를 조정하여 섹션을 얻을 수 있도록 합니다.
관심 지점에 도달할 때까지 블록을 10 마이크로미터 슬라이스로 트리밍합니다. 조직을 관찰할 수 있을 때, 작은 플랫 페인트브러시를 사용하여 연속 절단 동작으로 스탠드에 슬라이스를 부드럽게 당깁니다. 조직이 완전히 잘린 후 세부 브러시를 사용하여 슬라이스를 스테이지에 대고 평평하게 두드려보십시오.
자세한 브러시를 제거하고 슬라이스를 마무리하기 전에 약 20~30초 동안 섹션을 제자리에 고정합니다. 두 페인트 브러시를 사용하여 스테이지에 슬라이스를 부드럽게 평평하게 하여 롤링을 방지하고 스테이지에 대한 조직 섹션을 잡습니다. 20~30초 후에는 단면을 뒤집어 스테이지에 다시 평평하게 놓고 정전기로 충전된 슬라이드를 가까이 배치하여 슬라이스를 끌어들이고 슬라이드를 스테이지로 터치하지 않고도 슬라이드를 부착합니다.
일반적인 심장 결함의 존재를 위한 심혼 조직 단면도를 평가하기 위하여는, 카메라가 장착된 현미경을 사용하여, 5 10X 및 40X 배율에서 심상을 얻습니다. 심장 근육 다짐 분석을 위해 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에 관심있는 조직을 열고 이미지를 8 비트로 설정합니다. 이미지의 임계값을 설정하려면 이미지, 조정 및 임계값을 클릭하고 맨 위 막대를 이동하여 배경의 픽셀만 선택할 때까지 임계값을 조정합니다.
그런 다음 다각형 선택 도구를 사용하여 조직 주위의 관심 영역을 그린 다음 분석, 측정 설정, 영역 및 임계값제한을 클릭합니다. 강조 표시된 픽셀의 영역을 측정하여 음수 공간의 값을 얻으려면 분석 및 측정을 클릭합니다. 관심 영역 전체의 영역을 측정하려면 분석, 측정 설정 및 임계값 제한을 선택 해제합니다.
그런 다음 분석 및 측정을 선택하여 선택한 관심 영역의 전체 영역을 측정합니다. 근육 조직의 영역을 계산하려면 관심 영역의 영역에서 부정적인 공간의 영역을 뺍니다. 그런 다음 근육 조직의 영역을 관심 영역별로 나누어 근육 다짐과 X.수확된 배아 심혼에서 조직 조각의 염색은 조직 가장자리를 만들기에 충분한 대조를 제공하지만 세포 특징을 구별할 수 있도록 너무 어둡지는 않습니다.
이러한 대표적인 분석에서, 근육 다짐은 비실험적 조건하에서 개발된 배아에 비해 실험적인 심장에서 현저히 감소되는 것으로 관찰되었다. 이러한 샘플은 가치가 있으며 만드는 데 오랜 시간이 필요합니다. 부검과 특히 극저온 절개 하는 동안, 수행 하는 모든 행동에 대 한 의도적이어야 합니다.
Paraformaldehyde에서 조직을 보존하는 것은 형태 평가 도중 찾아낸 병리학적인 원인을 확인하는 것을 돕는 Aminofluorescein 얼룩 같이 시험을 위해 이용되는 견본을 허용하는 항원 활동을 유지합니다. 우리의 실험실에서, 우리는 다른 처리가 우리의 견본에 영향을 미치는 정도를 확인하는 것을 도울 수 있는 실험 처리의 정량적인 표현을 얻었습니다. 파라포멀데히드는 닿는 모든 조직을 고칠 수 있습니다.
항상 노출된 피부를 최소화하고 이 화학 물질로 작업할 때마다 필름 후드에서 작업할 수 있도록 장갑을 착용하십시오.
