Este protocolo estandariza las nuevas técnicas de análisis de tejidos para que puedan ser más utilizadas por otros grupos que también estudian defectos cardíacos congénitos. Como las técnicas de análisis cualitativo y cuantitativo tienen sus pros y sus contras, esta metodología utiliza ambas para abordar la más amplia gama de preguntas experimentales. Estas técnicas pueden tener un impacto positivo en los métodos de diagnóstico de cardiología.
Por ejemplo, los patólogos podrían aplicar nuestras técnicas microscópicas de análisis de tejido cardíaco para diagnosticar enfermedades cardíacas humanas a partir de muestras de biopsia. Este protocolo se puede utilizar para la cardiología del desarrollo o la investigación general de cardiología. Sin embargo, estos métodos también proporcionan varias técnicas útiles que se pueden aplicar hacia cualquier análisis de tejido.
Para recoger el día embrionario de 15 a 15,5 corazones, asegurar las extremidades de una presa embarazada y comenzando alrededor de la uretra hasta el esternón, cuidadosamente hacer una incisión en forma de I a lo largo del torso. Usando fórceps en un movimiento de scooping, levante suavemente el útero fuera de la cavidad abdominal agarrando los tejidos superficiales del útero según sea necesario con fórceps finos para ayudar en la extracción. Use tijeras para liberar el útero del abdomen.
Después de remojar el útero en PBS helado, coloca el órgano en una bandeja de disección. Usando tijeras, corte el útero en secciones individuales cada una que contenga un embrión separado. Usando dos pares de fórceps finos, pela suavemente los embriones del tejido uterino y colóquelos en un nuevo plato de Petri que contenga cuatro grados Celsius PBS-EDTA.
Para recoger los corazones, coloque el plato bajo un microscopio diseccionado y utilice dos pares de fórceps finos para colocar el embrión en la posición supina. Después de estabilizar el acceso al tórax, utilice el punto afilado de un segundo par de fórceps finos para hacer una incisión a lo largo del esternón del embrión que se extiende entre las clavículas hasta el ombligo. Haciendo incisiones muy finas y superficiales mientras se trabaja gradualmente hacia el interior de la cavidad torácica, abra el abdomen del embrión.
Cuando el corazón se haga visible, usa un par de fórceps para apretar el torso ligeramente acodado a la caja torácica para pelar las costillas abiertas. Usando los lados de un par de fórceps, agarra suavemente los vasos sanguíneos pulmonares sin separar el tejido y saca el corazón de la cavidad. Limpie el corazón en PBS-EDTA fresco durante uno o dos minutos antes de fijar el tejido en 4%Paraformaldehído durante 45 a 60 minutos.
Luego, lave el corazón tres veces durante 5 a 10 minutos por lavado en PBS complementado con glicina. Antes de almacenar los corazones en PBS a cuatro grados centígrados. Para preparar el corazón para la criocisión, coloque las muestras en un tubo de 30% sacarosa y PBS a cuatro grados centígrados durante 24 a 40 horas.
Cuando los corazones se hayan hundido en la parte inferior del tubo, utilice una pipeta Pasteur con una punta modificada para transferir cuidadosamente cada corazón a un pedazo de pelusa libre de pelusas. Después de un breve secado al aire, coloque cada muestra en moldes de temperatura de corte óptimos individuales en las orientaciones deseadas para el corte. Sumerja los tejidos en un medio de temperatura de corte óptimo sin burbujas.
Luego, almacene los moldes a 20 grados Celsius hasta unos días antes de congelar los tejidos a 80 grados Celsius durante al menos 24 horas antes de la criocciones. Para obtener secciones de criostato de las muestras, utilice un medio de corte de temperatura óptimo fresco para unir el bloque tisular de interés al mandril del criostato y permitir que el medio se congele hasta que sea blanco opaco. Inserte una nueva cuchilla y ajuste la distancia entre el bloque de tejido y la hoja para permitir la obtención de secciones.
Recorte el bloque en rodajas de 10 micrómetros hasta que se alcance el punto de interés. Cuando se pueda observar el tejido, utilice un pequeño pincel plano para tirar suavemente de la rebanada contra el soporte en un movimiento de corte continuo. Una vez que el tejido se ha cortado por completo, utilice el cepillo de detalle para acariciar la rebanada hacia abajo contra el escenario.
Mantenga la sección en su lugar durante aproximadamente 20 a 30 segundos antes de retirar el cepillo detallado y terminar el corte. Utilice ambos pinceles para aplanar suavemente la rebanada contra el escenario evitando cualquier balanceo y sostenga la sección del tejido contra la etapa. Después de 20 a 30 segundos, voltea la sección y aplana la parte contra el escenario de nuevo antes de colocar una diapositiva cargada electrostáticamente lo suficientemente cerca como para que la rebanada sea atraída y se adhiera a la diapositiva sin tener que tocar la diapositiva al escenario.
Para evaluar las secciones del tejido cardíaco para detectar la presencia de defectos cardíacos comunes, utilizando un microscopio equipado con una cámara, obtenga imágenes de aumentos de 5 a 10X y 40X. Para el análisis de compactación muscular cardíaca, abra un tejido de interés en un programa de software de análisis de imágenes adecuado y establezca la imagen en 8 bits. Para establecer el umbral de la imagen, haga clic en Imagen, Ajustar y Umbral y mueva la barra superior para ajustar el umbral hasta que solo se seleccionen los píxeles del fondo.
A continuación, utilice la herramienta selecciones de polígonos para dibujar una región de interés alrededor del tejido y, a continuación, haga clic en Analizar, Establecer medidas, área y Límite hasta umbral. Haga clic en Analizar y medir para medir el área de los píxeles resaltados para obtener el valor del área del espacio negativo. Para medir el área de toda la región de interés, haga clic en Analizar, Establecer medidas y anule la selección de Limitar al umbral.
A continuación, seleccione Analizar y medir para medir toda el área de la región de interés seleccionada. Para calcular el área del tejido muscular, reste el área de espacio negativo del área de la región de interés. A continuación, dividir el área del tejido muscular por el área de la región de interés para calcular la compactación muscular y X.La tinción de las rebanadas de tejido de los corazones embrionarios cosechados, proporciona suficiente contraste para hacer los bordes del tejido, pero no es tan oscuro como para hacer que las características celulares indistinguibles.
En este análisis representativo, se observó que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales. Estas muestras son valiosas y requieren mucho tiempo para crear. Durante las necropsias y la sección del criostato específicamente, asegúrate de ser intencional sobre cada acción que realices.
La preservación de los tejidos en Paraformaldehído mantiene la actividad del antígeno permitiendo que las muestras se utilicen para pruebas como la tinción de aminofluoresceína que ayudan a identificar las causas patológicas encontradas durante la evaluación de la morfología. En nuestro laboratorio, obtuvimos representación cuantitativa de tratamientos experimentales que nos pueden ayudar a identificar el grado en que diferentes tratamientos afectan a nuestras muestras. El paraformaldehído puede fijar cualquier tejido que toque.
Tenga cuidado de usar siempre guantes para minimizar la piel expuesta y trabajar en una capucha de película cada vez que trabaje con este producto químico.
