PBMC 및 플라즈마 샘플은 초기 임상 개발에서 획득하기 간단하고 매우 유익합니다. 이 강력한 프로토콜은 임상 현장에서 도입된 사전 분석 가변성을 최소화합니다. 이 프로토콜은 빠르고 쉽기 때문에 혈액을 PbMC 및 플라즈마로 처리하기 위해 기본 실험실 장비와 최소한의 작업자 전문 지식이 필요합니다.
그것은 병원에서 바쁜 실험실 일과 호환됩니다. 이 프로토콜에서 유래 된 혈액 성분의 다운스트림 분석은 약물 역학 및 약동적 관계, 약물 투여 량 스케줄링 및 표적 참여 증명을 알리고 약물 행동 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하여 실시간 및 내성 분석을 모두 지원할 수 있습니다. 우리는 특히 DNA 손상 반응 메커니즘을 분석하기 위해 종양학 연구를 위해이 프로토콜을 사용합니다.
그러나, 이 프로토콜에 의해 수집된 물질은 많은 질병 지역 및 다중 치료 양식에 걸쳐 관련될 수 있습니다. 샘플 당 기증자 혈액의 8 밀리리터를 받은 후, 혈액이 그려진 시간을 기록하고 방사선에 표지된 각 튜브로 항응고제 처리 혈액 샘플을 전송하기 전에 각 튜브를 8~10회 부드럽게 반전시한다. 임상 샘플의 경우, 튜브를 반전한 직후원심분리합니다.
0.2 회색 튜브를 미리 데운 엑스레이 캐비닛에 놓고 문을 닫고 튜브에 0.2 회색 복용량을 적용합니다. 저용량 조사 튜브를 7개의 회색 튜브로 대체하고 복용량을 조정하여 고용량 조사 샘플에 7개의 회색 방사선 량을 적용합니다. 두 샘플을 조사 한 후, 한 시간 동안 섭씨 37도에서 튜브의 세 가지 모두를 배양.
고속 원심분리로 세포를 분리하기 전에 샘플을 셀 준비 튜브로 옮기고, 단위를 x g 또는 동등한 RCF로 설정해야 합니다. 원심 분리 후, 어두운 배경에 대한 튜브를 보고 플라즈마, 적혈구 및 버피 코트 층을 식별합니다. 혈청 피펫을 사용하여 플라즈마의 약 절반을 15 밀리리터 원심 분리기로 옮기고 버피 코트 층을 방해하지 않고 젖은 얼음에 플라즈마 튜브를 저장합니다.
그런 다음, 목초지 파이펫을 사용하여 버피 코트 층을 포함하는 전체 PBMC를 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 실온 PBS를 PBMC에 샘플 당 15 밀리리터의 최종 부피로 추가합니다. 부드럽게 반전에 의해 세포를 혼합 하고 낮은 속도로 원심 분리에 의해 세포를 수집, 원심 분리 단위를 확인 하 고 있는지 확인. 펠릿을 방해하지 않고 마지막 500 마이크로 리터를 제외한 모든 흡인.
신선한 PBS를 각 튜브에 10 밀리리터의 최종 볼륨에 추가하고 튜브를 부드럽게 반전시켜 다시 중단합니다. 계산을 위해 세포의 40 마이크로 리터 알리쿼트를 사용합니다. 계산 후, 다른 원심 분리와 세포를 수집하고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상퍼를 제거합니다.
나중에 처리를 위해 PBMC를 저장하려면 부드러운 파이펫팅으로 샘플당 50 마이크로리터의 신선한 PBS로 펠릿을 다시 중단하고 각 셀 서스펜션을 젖은 얼음에 1.5 밀리리터 극저온으로 옮기습니다. 그런 다음 바람직한 방법으로 셀을 얼리고 영하 80도의 동결 상자에 놓습니다. 셀이 동결된 시간을 기록합니다.
대안적으로, 샘플 당 1 밀리리터 또는 동결 혼합물에서 펠릿을 다시 중단하고 개별 표지된 극저온으로 세포 현탁액을 전송한다. 그런 다음 튜브와 미리 차가운 냉동 상자를 영하 80도 저장합니다. 플라즈마를 동결하려면 잔류 펠릿을 방해하지 않고 최대 5개의 2밀리리터 마이크로튜브까지 플라즈마를 1밀리리터 알리쿼트까지 추가하고 각 튜브의 플라즈마 총 량을 기록합니다.
그런 다음, 즉시 영하 80도 냉동고에서 직립 방향으로 플라즈마 알리쿼트를 동결. 시료의 서양 얼룩 분석을 위해, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 적절한 양의 용액 버퍼로 각 튜브의 펠릿을 부드럽게 파이펫팅으로 보충하고 얼음에서 10 분 동안 세포 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면 샘플을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30초 동안 30초로 초음파 처리합니다.
원심분리로 샘플을 수집하고 슈퍼네티츠를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 그런 다음 시료당 40 마이크로그램을 적재 버퍼와 혼합하고 샘플을 5분 동안 끓입니다. 4-12%의 비스-트리스 단백질 젤에 차선당 각 샘플 20마이크로그램을 복제하여 SDS-PAGE를 실행합니다.
혈액의 8 밀리리터에서 얻은 세포의 수는 환자 및 질병 설정에 따라 다릅니다. 일반적으로, 세포 펠릿은 크기가 작고 투명한 흰색입니다. 때때로 펠릿은 준비의 질에 부정적인 영향을 미치는 몇몇 적혈구 오염이 있을 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하는 만성 림프구성 백혈병 환자의 전형적인 수율은 밀리리터당 1.62 내지 19.77 밀리그램 에 이르는 최종 단백질 농도를 가진 8밀리리터 단일핵 세포 제제당 1.62배에서 1.99배 내지 1.99배 10내지 9번째 세포까지 다양하다. 3명의 환자 견본의 이 대표적인 분석에서는, 번역 후 수정에 있는 증가가 더 높은 이온화 방사선 량에서 관찰되었습니다. 흥미롭게도, 실조-텔란지크시아 돌연변이 및 RAD50의 인산화는 0.2 그레이의 낮은 용량에서 상당했으며, 이는 이러한 번역 후 변형이 종양의 좋은 동적 범위와 함께 DNA 이중 가닥 의 생성을 포함하는 치료법을 위한 약력 동적 바이오 마커로 구현될 수 있음을 시사합니다.
최적의 시료 준비를 위해 실온에서 수집한 지 1시간 이내에 혈액을 처리하고, 샘플을 원심분리하고, 어두운 배경에 대해 튜브를 보고 버피 코트를 구별할 수 있습니다.
