이 작품은 KT에 국립 보건원 (NCI R00 CA132784)에 의해 지원되었다

1. 탯줄 혈액에서 Mononuclear 세포의 분리 <ol><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 95 ML 린스 버퍼 (1시 20분 희석) 5 ML 소 혈청 알부민 (BSA) 재고 솔루션을 버퍼 추가 준비합니다. 가스를 제거하다 버퍼과 얼음의 버퍼를 유지 중요 :. 가스를 제거하다에 실패 CD19을 분리 할 때 버퍼가 최적의 결과보다이 발생할 수 있습니다 + 거품 절연 열을 차단할 수 있습니다 B-세포 때문입니다. </li><li> 밀도 기울기 원심 분리 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 탯줄 혈액을 처리하는 데 필요한 튜브의 수 (1 관 8 ML의 피를 처리 할 수​​)를 결정하고 각 튜브에 Ficoll-Paque PLUS 15 ML를 추가합니다. </li><li> 24 ML의 DPBS (1X)과 조심스럽게 층 50 ML 원뿔 튜브의 각 Ficoll-Paque PLUS 상단에 희석 코드 혈액 혼합물을 함께 탯줄 혈액 8 ML을 희석. 피와 Ficoll-Paque PLUS를 섞지 마십시오 중요 ​​:. 코드 혈액과 Ficoll-Paque PLUS의 혼합 방지하기 위해, 45도 각도로 관을 잡고레이어 혈액 혼합 천천히. </li><li> 20 ° C.에 40 분 400 XG에 원심 분리기 Mononuclear 세포 (MNC)은에 유지됩니다 플라스마 Ficoll-Paque PLUS 인터페이스 Ficoll-Paque PLUS의 삼투압에 높은 밀도로 인해 침전 과립 성 백혈구와 적혈구 반면. 샘플 ID, 날짜 및 다음과 같은 제 3 부에 사용되는 라벨 칠 5 ML 내내 아래로 튜브 : </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 관 </td><td> 상표 </td><td> 목적 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 흠없는 </td><td> 유동 세포 계측법 동안 정상화를위한 흠없는 세포 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 7AAD </td><td> 유동 세포 계측법 동안 생존을 확인하려면 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> 정렬 될 셀을 포함 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> CD34 + / CD19를 수집하려면 +(후반 프로-B - 초 전 BI) 세포 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 낮은 45 </td><td> / CD19 낮은 + / CD45 (예정 BI) 세포 - CD34를 수집하려면 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 메드 </td><td> / CD19 + / CD45 메드 (예정 BII) 세포 - CD34를 수집하려면 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 고 45 </td><td> / CD19 + / CD45 고 (미숙 B) 세포 - CD34를 수집하려면 </td></tr></tbody></table> 코트 튜브 4, 5, 6, 7 2퍼센트 FBS로하고 얼음에있는 모든 튜브를 놓습니다. <ol start="5"><li> 주의 깊게 상위 플라즈마 층을 기음과 mononuclear 세포 층과의 접촉을 피하십시오. 10 ML 유리 피펫 사용하여, 신중하게 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 mononuclear 세포 레이어를 전송할 수 있습니다. 하나의 50 ML 튜브에 함께 셋 튜브에서 mononuclear 세포를 결합합니다. </li><li> PBS로 관을 채우기에서 10 분 300 XG에 부드럽게 혼합 원심 분리기20 ° C. 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 1X를 반복합니다. 첫 번째 세척 후 알약을 resuspend하고 단일 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 PBS 200 μl의 세포 펠렛을 resuspend. , 세포 현탁액 1 μl를 제거 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 PBS 1 ML에 추가하고 (원심 분리기에서 50 ML 세포 현탁액을 삽입 한 후 셀을 계산) 계산을 위해 따로 설정합니다. PBS로 관을 입력하고 혈소판을 제거하는 15 분을 위해 200 XG에 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서 완전히 표면에 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 2. 맥 분리를 사용하여 Mononuclear 세포에서 수정 된 B-세포 절연 <ol><li> 160 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼로 단계 1.7에서 펠렛을 Resuspend. </li><li> 40 μl B-CLL 비오틴 항체 칵테일을 추가합니다. 4 ° C.에 잘 섞어 10 분에 품다하는 피펫 </li><li> 세포를 씻으 - 1 ML 감기 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 만 10 당 세포 (세포 뉴 추가mber 단계 1.7)에 결정하고 10 분 300 XG에 원심 분리기. 완전히 표면에 뜨는을 대기음 후 320 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼에있는 셀 펠렛을 resuspend. </li><li> 80 μl 방지 비오틴 MicroBeads을 추가, 4 ° C.에 잘 섞어 15 분에 품다 </li><li> 세포를 씻으 - 1 ML 추위 10 분 300 XG에서 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 만 10 당 세포와 원심 분리기를 추가합니다. 감기에 500 μl (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼으로 1 억 명의 셀 Resuspend. 휴대폰 번호에 따라 크기 버퍼 볼륨입니다. </li><li> 원심 분리 (단계 2.5) 동안 맥 열 및 Mac 구분 기호를 준비합니다. 맥 구분의 자기장에 LS 열을 놓고, 차가운 3 ML (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 열로를 추가하고 버퍼 칼럼을 통해 똑 할 수 있습니다. 를 통해 흐름을 잡아 소켓을 사용합니다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 항목 아래의 50 ML 원뿔 튜브를 놓고 열에 세포 현탁액을 피펫. 라벨이없는 세포 통해서을 똑 할 수 있도록 허용H는 열 및 50 ML 원뿔 튜브에. 중요 :이 항체 라벨과 셀 정렬에 사용되는 셀입니다. 을 통해 흐름을 폐기하지 마십시오. 단계 2.5에서의 모든 셀을 복구하려면, 원추형 튜브의 벽에 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼의 추가 한 ML을 추가합니다. 부드럽게 섞어서 열에 남아있는 세포 현탁액을 피펫. 1X를 반복합니다. 열 통과 후 원뿔 튜브에 수집 된 라벨이없는 세포를 사용하여 2.8 단계로 진행합니다. </li><li> 10 분 300 XG에서 PBS와 원심 분리기와 라벨이없는 세포를 포함하는 원뿔 튜브를 입력합니다. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 제거합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 200 μl를 추가하고 부드럽게 세포를 resuspend. </li></ol> 3. 셀 정렬에 대한 항체 라벨링 및 준비 <ol><li> (단계 1.4) &quot;흠없는&quot;이라는 튜브에 세포 현탁액 및 장소 1 μl를 대기음. 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼를 추가하고 얼음에 튜브를 저장합니다. </li><li> 20 추가나머지 세포 현탁액에 백만 셀 당 각 항체의 μl (CD19, CD34 및 CD45). 잘 섞어서 RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 튜브를 놓습니다. 불이 해제와 함께 CD 항체 2-4 빛에 민감한, 완료 단계입니다. </li><li> 항체와 부화의 30 분 후, 세포 현탁액의 40 μl를 기음과 &quot;7AAD&quot;이라는 튜브에 넣습니다. 2 분 500 XG에서 튜브와 원심 분리기로 1 ML PBS를 추가합니다. 표면에 뜨는를 제거하고 바인딩 버퍼 100 μl의 세포를 resuspend. 7AAD 7 μl (7 Aminoactinomycin D)를 추가하고 RT에서 10 분 동안 짙은 어둠 속 품다. 10 분 부화 단계를 완료 3.4 동안. </li><li> CD 항체가 표시된 남아있는 세포를 포함하는 관의 상단에 PBS를 추가합니다. 3 분 500 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는을 제거, 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼를 추가하고 셀 펠렛을 resuspend. &quot;+ + +&quot;이라는 튜브에 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송합니다. 세포 현탁액의 모든 복구하려면&quot;+ + +&quot;표시 관에 50 ML 원뿔 튜브 및 전송에 DD는 추가 한 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼. </li><li> 부화 후 (단계 3.3), 7AAD 튜브에 300 μl 바인딩 버퍼를 추가 할 수 있습니다. &quot;흠없는&quot;, &quot;7AAD&quot;와 &quot;+ + +&quot;샘플 &quot;34 +&quot;, &quot;45 낮은&quot;, &quot;45 메드&quot;와 &quot;45 고&quot;튜브는 유동 세포 계측법에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 4. MoFlo XDP 흐름 Cytometer를 사용하여 셀 정렬 <ol><li> 정렬에 대한 설정 MoFlo는 : 레이저를 정렬, 비말 스트림을 안정화, 드롭 지연을 결정합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen ABC 마우스 구슬 키트를 (또는 이와 유사한 것)를 사용하여 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다. 긍정적이든 부정적 인구의 최적 분리에 대한 형광 채널의 전압을 조정, 단일 색상 컨트롤을 실행합니다. 보상 계수를 설정하고 보상 매개 변수를 수집 프로토콜에를 적용 할 수 있습니다. 보상 계수에게 항체의 새 많은 취득 때마다 다시 설정합니다. </li><li> 그림 2와 같이 플롯 등의 프로토콜을 만듭니다. </li><li> , 흠없는 샘플을 실행 전압과 순방향 및 측면 분산을위한 게인을 설정하고 부정적인 형광 인구를 식별합니다. DNA 복구는 종류의 목표이기 때문에, 기준 액은 DNA 함유 파편 복구 샘플을 오염하지 않습니다 (≤ 1 %) 낮은 수 있도록 설정해야합니다. * 에어로졸 피난 시스템은 인간의 세포는 MoFlo에서 실행되는 생활을 항상 실행되고 있는지 확인합니다. </li><li> 게이팅 전략 (그림 2)를 설정합니다 + + + 샘플 (~ 50,000 이벤트)의 작은 나누어지는을 실행합니다. B-세포 progenitors은 B-세포를 성숙에 동일하게 분산하지 않으므로, 림프구 게이트 잠재적 인 프로-B 세포를 포함하기 위해 SSC 대 FSC 계획에 + / CD34 + 인구 ungated CD19을 backgate. 이 샘플에서도 7AAD에 대한 부정적인 형광 인구를 설정합니다. </li><li> 샘플 생존을 결정하는 7AAD 샘플을 실행합니다. 에서 높은 경쟁력있는 샘플에서 정렬 셀죽은 세포와 같은 초기은 (≥ 95 %) 무차별 착색하고 정렬 인구를 오염 할 수 있습니다. </li><li> 네 인구를 수집하기 위해 정렬 결정을 설정 : CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 낮은, CD19 + / CD34 - / CD45 의대, 그리고 CD19 + / CD34 - 고 / CD45. 모든 인구의 정렬 결정에 림프구와 쌍으로 된 것 차별 게이트를 포함합니다. </li><li> 정렬 팁에 나막신을 방지하기 위해 필터 + + 바로 정렬 및 집계는 정렬하는 동안 샘플에서 발생하는 경우 다시 필터 전에 40 μm 셀 스트레이너를 통해 + 샘플. </li><li> 냉각 또는 얼음 포장 튜브 홀더에 PBS에서 2퍼센트 FBS으로 코팅 수집 튜브 (단계 1.4)으로 세포를 정렬합니다. </li><li> 정렬이 완료 직후, DNA의 압축을 풉니 다. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

저자는 공개 할 수 없어요.

프로토콜의 성공에 가장 큰 영향 요인은 파편을 오염의 존재입니다. 코드 혈액 은행에서 혈액을 요청하는 경우에는 혈액이 빨리 수집 한 후 가능한 한 출하하는 것이 중요합니다. 또한, lymphocytosis으로 분류 된 샘플 림프구 높은 숫자를 포함하지만, 이러한 샘플 전구체 B-세포의 충분한 숫자가없는 사용하지 않아야합니다. 우리는 탯줄 혈액의 적어도 85 ML로 시작하는 것이 좋습니다 전구체 하위 집합 각각에 대해 세포의 충분한 숫자를 획득 확률을 증가 할 수 있습니다. 그것은 성인 말초 혈 분리는 달리, 탯줄 혈액을 fractionating 때 mononuclear 레이어가 종종 적혈구 12 오염이 오니, 이용에 참고하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 오염 혈소판을 제거 할 수있는 별도의 세척 단계가 포함되어 있습니다. 탯줄 혈액에서 mononuclear 분리를 설명하는 프로토콜은 용해 단계 t 등의 제안원치 않는 붉은 세포를 제거 O. 이 오염 파편을 생산하고 세포 종류의 성공에 부정적인 영향을 가지고 있기 때문에 우리는이 단계를하지 않는 것이 좋습니다. 유동 세포 계측법에 의해 구별 할 필요가 세포의 수를 줄이기 위해 그 전에 셀 정렬에 B-세포 농축을 수행 할 필요가 있습니다. B-셀 절연 키트 (B-CLL)을 함께 Miltenyi Biotec,에서 제공 프로토콜은 말초 혈에 대해 최적화되어 있으며 10,000,000 세포 당 10 μl B-CLL 비오틴 항체 칵테일을 사용하는 것이 좋습니다되었습니다. , CD4 (T 세포), CD11b (과립 성 백혈구, 단핵 세포, 대 식세포), CD16 (NK 세포, 대 식세포, 마스트 세포), CD36 (혈소판), CD235a (erythroid 세포),이 단계 CD2 (NK 세포 T 세포)에 대해 항체를 사용 탯줄 혈액에서 비-B 세포를 고갈합니다. 이 전 키트는 프로-B 세포에 존재하는 CD43에 대한 항체가 포함되어 있기 때문에 설명 된 키트가 아닌 B-세포 분리 키트 II를 사용하는 것이 중요합니다. 우리 조합 중이 프로토콜의 timization, 우리는 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 40 μl의 총 긍정적 인 셀 정렬 결과를 생산하기에 충분한 것으로 나타났습니다. 또한 우리는 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 최소 5와 μl 더를 사용하여 셀 정렬에 부정적 영향을 가지고있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 고도의 175-250000000 사이의 총 mononuclear 세포 숫자를 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 40 μl를 사용하는 것이 좋습니다. 세포의 낮은 또는 높은 숫자로 시작하는 경우가 그에 따라 시약을 확장 할 필요가있을 수 있습니다. B-세포의 하위 인구 구별하는 데 사용할 수 있습니다 마커를 설명하는 수많은 충돌 간행물가 있습니다. 차이의 대부분은 차별화가 지속적 과정이며, 세포 표면 마커의 유무가 점진적 방식으로 대신 전부 또는 아무것도 방식으로 발생한다는 사실에 의해 설명 될 수있다. / CD19 + 및 CD45 + (의 강도 수준 -이 프로토콜 CD34에낮은) 높은, 중간 표현은 차별화 6의 진행에 해당하는 CD45 표현의 수준 증가와 함께 사전 BI, 사전 BII와 미숙 한 B-세포를 구별하는 데 사용되었다. 프로 B 세포는 CD19 할 몇 가지에 의해 설명 된 + / CD34 + 13 다른 프로-B 세포가 CD19 아르 것으로 나타났습니다 동안 - / CD34 + 및 사전 BI 세포가 CD19 + / CD34 + 9,10 있습니다. 이러한 불일치를 바탕으로 우리는 늦은 프로-B 세포 / 초 사전 BI 세포로 CD19 + / CD34 + 세포를 지정하고 있습니다. 그것은이 전략을 구체 질병 급성 lymphoblastic 백혈병에 의해 영향을 세포에 해당하는 B-세포의 일부를 분리하기 위해 개발 된 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 관심의 세포 하위 유형에 따라 사용될 수있다 여러 정렬 전략이 있습니다. 항체 - fluorochrome 조합은 사용 가능한 셀 정렬의 기능에 따라 선택해야합니다. 장군으로리터 규칙, 당신 패널의 밝은 fluorochrome은 적어도 인구가 항원과 반대의 라벨을 사용해야합니다. 특히 이중 스테인드 인구, 다음과 같은 희귀 한 이벤트를 감지에서 이중 어 차별 (그림 2B)는 게이팅 전략의 극히 중요한 부분입니다. 이것은 두 번 긍정적 인 이벤트가 항체와 서로 준수 단순히 두 개의 싱글 - 스테인드 세포 모두 물들 진정으로 하나의 세포 보장합니다. 고속, 4 방향 전지 정렬 반드시 통제 된 에어로졸 환경을 만듭니다. 따라서, 라이브 인간의 세포 정렬은 아주 조심 수행해야합니다. 게시 안전 및 오염 제거 지침은 가능하며 정렬 14 전에 검토하고 구현해야합니다. 기관 바이오위원회 또는 등가물의 승인을 분류하기 전에해야 할 수 있습니다. 정렬 후 적절한 정화를 들어, 표백제는 10 %의 최종 농도에 폐기물 컨테이너에 추가해야합니다. 시milarly, 모든 샘플 튜브뿐만 아니라이 지역의 모든 표면은 철저하게 갓 만든 10 % 표백제 용액으로 소독해야합니다. 요약이 프로토콜은 전구체 B-세포의 희귀 한 인구를위한 전략을 제공하며, 조혈 줄기 세포와 T-세포 미숙 등의 탯줄 혈액에 존재하는 희귀 한 인구를 분리하도록 수정 될 수 있습니다. 최근 미숙 한 B 세포는 고급 HIV 15 개인의 말초 혈에서 확인되었습니다. 따라서,이 방법의 유틸리티는 혈액 암의 연구 초과합니다. 마지막으로, 우리는 아직 흐름이 정렬 세포에서 RNA의 isolations를 수행하지 않은하지만,이 방법은 셀 동안 세포 RN​​easy 키트에서 trizol이나 RLT 등 상응하는 RNA 호환 솔루션에 직접 정렬해야 정렬한다는 점을 유의 적응해야합니다 Qiagen를 통해 사용할 수 있습니다.

질병에 존재 aberrations를 확인하기 위해, 우리가 건강한 조직 또는 질병에 의해 영향을 조직 또는 세포 유형에 해당하는 세포를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 이것에 대한 이유 중 하나는 조직 유형 간의 epigenetic 변화는 유전자 발현을 조절하기위한 책임이 있으며 정상적인 인간 개발 1,2 동안 세포 차별화에 중요합니다. 두 번째 이유는 비정상 조직 특정 유전자 조절은 정상 개발에 끔찍한 결과가 초래 될 수 있습니다 및 암 등의 질병 상태의 다수에 기여하는 것으로 알려져이다. 따라서, 조혈 세포를 포함 질병의 더 나은 이해가 건강한 조혈 세포에 대한 지식이 필요합니다. 세포 표면의 표현의 변경을 특징으로 사건의 체계적인 순서를 통해 골수 진행에 조혈 세포의 개발은 3 마커. 성인 참가자를 포함하는 연구가소아 참가자를 포함한 연구 전구체 B-세포의 비율이 덜 5 세 6 개인의 상대적으로 높은 것으로 나타났습니다 반면, 골수는 보통 B-세포 4,5 전구체의 낮은 번호를 포함 표시. 탯줄 혈액은 혈액 관련 질환과 malignancies의 치료에 조혈 줄기 세포의 원천으로 사용 탯줄 혈액 은행을 통해 쉽게 사용할 수 있으며 대상 백혈병 등의 여러 질환의 세포이며 미성숙 B와 T 세포 7 농축되어있다 lymphomas. 골수의 전구체 B-세포가 광범위하게 8,9를 phenotyped 된 독특한 하위 집합으로 셀을 정렬하는 데 사용할 수있는 특정 세포 표면 마커의 존재로 정의 할 수 있습니다. 일반 B-세포 분화의 초기 프로-B 세포로 시작하고 미숙 또는 순진한 B-세포에 culminating 골수의 단계 일련의를 통해 진행. 에 따르면반 Zelm 및 동료 10, 프로-B 세포는 CD34의 존재에 의해 무대 2의 전환 (사전 BI)에 CD19이 취득 특징을 가지고 있습니다. 3 단계 (사전 BII) 세포는 더 이상 CD34 Express 및 세포질 IgM을 표현하기 시작합니다. 마지막으로, 4 단계의 정의 특징은 (B-세포 미숙) 표면 IgM의 표현입니다. 이 프로토콜에 설명 된 정렬 전략이 처음 콜드웰 및 동료 6 설명과 크게 복잡성과 셀 정렬 실험을 수행 비용을 절감 불과 3 세포 표면 마커의 사용을 포함했다. 자신의 작품에서 CD45 사이의 관계와 B-세포 분화의 단계가 설립되었습니다. 그들은 골수에서 B-세포가 CD45의 표현의 변수 수준을 표시 관찰했다. 특히, CD45 높은 수준의 표현 세포 표면 IgM을 표명 세포 (미숙 한 B-세포)에 대응, CD45의 중간 수준을 표시하는 페이지는 cytopl을 표명 셀에 대응asmic IgM (예정 BII 세포) 및 CD45의 낮은 수준을 표시하는 페이지는 (예정 BI 세포) 세포질 IgM을 표현하지 않은 셀에 대응. 이 프로토콜은 methylated - 포장 소비재 섬의 복구 분석 등 고품질 핵산의 산을 필요로하는 다운 스트림 assays에서 사용할 수있는 탯줄 혈액 (그림 1)에서 B-세포 (MIRA 전구체의 일부를 분리 할 수 콜드웰 및 동료 6 개발 전략을 사용하여 ) 11 및 정량 실시간 PCR의 assays. 방법은 탯줄 혈액에서 모든 비-B 세포를 고갈에 자기 구슬을 사용하여 초기 분리 직원을 고용하고 있으며 단 3 항체 (CD34, CD19 및 CD45)와 얼룩 필요합니다. 복구하는 세포는 B-세포 분화의 4 단계를 나타냅니다 : 1) CD34 +; CD19 + (후반 프로-B 및 사전 BI 초), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 낮은 (말 사전 BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 메드 (예정 BII) 및 4) CD34 -; CD19 +; CD45 높은 (미숙 한 B-세포).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

탯줄 혈액은 매우 다른 계보 (Lineage) 헌신의 단계에서 조혈 전구 세포에 풍부합니다. 우리는 B-세포 분화의 네 가지 단계에서 전구체를 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다. 유전자가 표현과 epigenetic 수정은 조직 특정 방식으로 발생되기 때문에,이 게놈과 질병의 발전으로 이어질 수 있습니다 epigenome의 변경을 식별 할 수하기 위해 조직 및 세포 유형 간의 차별하는 매우 중요합니다. 이 방법은 차별화의 단계에서 탯줄 혈액에서 세포 존재하는 모든 종류의에 적응 할 수 있습니다. 이 방법은 4 주 단계를 포함한다. 첫째, mononuclear 세포 밀도 원심 분리에 의해 구분됩니다. 둘째, B-세포 mononuclear 세포에서 비 B-세포를 인식하고 제거 비오틴 복합 항체를 사용하여 풍부하고 있습니다. 제 B-셀은 휘황 개별 단계에 해당 세포 표면 단백질 항체으로 분류됩니다B-세포 개발. 마지막으로, 휘황 레이블 셀이 정렬되어 있으며 각각의 인구가 복구됩니다. 복구 세포는 하류 핵산 assays에서 이용 될 수있는 충분한 수량과 품질입니다.

샘플 사이에 차이는 셀 정렬 (표 1)의 성공에 역할을합니다. 좋은 성공 속도로 샘플 오염 파편의 낮은 수준 (그림 3A)가 가난한 성공 속도로 샘플 오염 파편 높은 수준의 (그림 3B)가. 코드 혈액 샘플을 선적 24 시간 (O / N 우선) 내에서 수집 한 경우 샘플 사이에 변화가 다소 제어 할 수 있습니다. 각 전구체 B-세포 부분 집합의 흐름 정렬 전지는 충분한 수량과 핵산 isolations을 수행 할 품질입니다. 고립 된 DNA는 높은 품질이며, 하류 분석에 사용할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 methylated DNA (그림 4)에 대한 풍부 MIRA 11이 DNA를 사용합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 탯줄 혈액 시설 데이터 </td><td> 나쁨 정렬 </td><td><st롱&gt; 좋은 정렬 </td></tr><tr><td> 항응고제와 협력 혈액 양 (ML) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> 백혈구 [10 3 / μl] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td> 림프구 [10 3 / μl] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td> 림프구 (%) </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td> 적혈구 [10 6 / μl] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> 자체 데이터 </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque 후 휴대폰 번호 </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> 맥 분리 후 휴대폰 번호 </td><td> 22 M </td><td> 16.5 M </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 카운트 (MoFlo XDP) </td><td> 30.57 M </td><td> 19.97 M </td></tr><tr><td> 생존 (%) </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td> 림프구 게이트의 셀 (%) </TD&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 10,959 </td><td> 48,316 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - 낮은 / CD45 </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 16,619 </td><td> 26,941 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 메드 </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - 고 / CD45 </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> 표 1. 대표 셀 정렬 통계. 행 1-5 탯줄 혈액 시설에서 제공하는 중요합니다. 나머지 행은 우리의 연구실에서 데이터를 수집합니다. 가난한 정렬은 파편 높은 수준의와 림프구 게이트에서 세포의 낮은 비율이 포함되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figu1 다시. 절차의 흐름 차트입니다. 탯줄 혈액이 처리되고 mononuclear 세포는 Ficoll-paque 플러스를 사용하여 절연하고 있습니다. 추가 세척 단계는 오염 혈소판을 제거하는 포함되어 있습니다. B-세포는 맥 인간 B 세포 절연 키트 (B-CLL)를 사용하여 mononuclear 세포로부터 분리되어 있습니다. 이 단계는 모든 비-B 세포를 제거하는 (CD2, CD4, CD11b, CD36, 안티 IGE와 CD235a) 비오틴 - 복합 단클론 항체를 사용합니다. 복구 B-세포는 다음 전구체 B-세포 하위 집합을 복구 할 수있는 MoFlo XDP 흐름 cytometer를 사용 정렬 CD19-APC, CD34-PE 및 CD45-FITC 항체으로 분류됩니다 : CD19을 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 , CD19 + / CD34 - / CD45 의대, 그리고 CD19 + / CD34 - 고 / CD45. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> 그림 2. 팝업을 파악하고 분류 게이팅 전략ulations. 빨간색 화살표는 다음 플롯에 적용됩니다 게이트를 나타냅니다. R4, R5, R6 및 R7 문은 정렬 인구를 나타냅니다.) 앞으로 대 강화 림프구 인구를 보여주는 사이드 분산 형 플롯. R1, 림프구 게이트. b)는 높이 대 단일 세포 대 doublets를 식별하기 위해 앞으로 분산 형 플롯의 너비. R2, 단일 셀 게이트. C) CD19-APC 긍정적 인 세포는 CD34-PE 부정적 및 긍정적 인 인구로 나눌 수 있습니다. R3, CD19 + / CD34 - 게이트, R4, CD19 + / CD34 + 게이트 나타내는 원하는 정렬 인구 D) CD19 + / CD34 - 세포 세 다소 독특한 CD45-FITC 인구로 나눌 수 있습니다.. R5 및 R6, CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 CD19 + / CD34 - / CD45 의대 인구, 각각. R7은 때문에 CD19 + / CD34 높은 세포 숫자 - 높은 인구 / CD45, 이러한 종류의 게이트 만 포함인구의 부분입니다. 이 인구의 모든 세포는 하류 분석을 위해 수집 할 필요가 없습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> 그림 3.) 항목을 농축 한 후 파편을 오염 낮은 수준. R1, 림프구 게이트. b)는 열 농축 한 후 파편을 오염 높은 수준의. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> 4 그림. 전구체 B-세포의 하위 집합에서 methylated DNA의 농축이 있습니다. 전구체 B-세포 하위 집합에서 격리) Sonicated DNA는 높은 품질입니다. 도서관 건설 DNA를 들어 200-600 BP의 평균 sonicated 수 있습니다. 레인 1 : Promega 100 BP의 사다리 (카탈로그 # G2101), 차선 2 : 격리 총 DNA CD19에서 + / CD34 + 세포, 차선 3 : CD19로부터 격리 총 DNA + </s최대&gt; / CD34 - / CD45 낮은 세포, 차선 4 : CD19 + / CD34로부터 격리 100 NG DNA - / CD45 의대 세포, 차선 5 : CD19 + / CD34로부터 격리 100 NG DNA - / CD45 높은 세포. DNA는 9 분 (; 30 초 OFF ON 30 초)의 총 고등학교에 Diagenode의 Bioruptor를 사용하여 sonicated되었습니다. DNA는 열 정화이고 SYBR 녹색 핵산 젤 얼룩과 1 % 아가로 오스 겔에 시각화. B) MIRA는 ActivMotif MethylCollector 울트라 키트, SLC25A37과 PCR (1-6)와 APC1 (7-12)를 사용 후는 확인을 위해 수행됩니다 methylated DNA의 농축. 1 &amp; 7 : Sonicated 게놈의 DNA (NO MIRA), 2 및 8 : MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 &amp; 9 : MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 DNA, 4 &amp; 10 : MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 의대 DNA, 5 &amp; 11 : MIRA - CD19 + / CD34 - / CD45 높은 DNA, 6 &amp; 12 : 물 제어 할 수 있습니다. SLC25A37 높은 증폭는 methylated DNA의 농축을 확인전구체 B-세포의 하위 집합 인치

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Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K 조회수.  University of Missouri-Columbia. 여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

마우스 복막 구멍 세포의 분리

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

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