Nuestro método es significativo porque permite a los investigadores aislar y manipular diferentes tipos de células para la investigación de sus contribuciones individuales de linaje a la forma y función del tejido. Esta técnica es un método suave y eficaz para separar los tipos de celda y, como resultado, la integridad de las celdas se conserva para el cultivo 3D. Esta técnica también se puede aplicar a otros sistemas para aislar células que no tienen biomarcadores bien caracterizados.
Para cosechar las glándulas mamarias número dos, tres, cuatro y cinco de un ratón hembra de 10 a 14 semanas de edad, primero haga una incisión de un centímetro en la línea media entre las dos extremidades posteriores. Extienda el corte hasta el cuello y haga pequeños cortes laterales desde la incisión de la línea media hacia las extremidades. Luego estira la piel enseñada antes de asegurarla con un alfiler a cada lado del animal.
Usando fórceps, recoge los ganglios linfáticos de las glándulas número cuatro. Para eliminar las glándulas mamarias, utilice tijeras afiladas para cortar debajo de cada región de tejido, colocando los tejidos en 50 mililitros de cuatro grados Celsius DMEM-F12 complementados con 5%FBS y antibiótico-antimicótico a medida que se cosechan. Cuando se hayan recogido todos los tejidos, corte las glándulas hasta que las piezas puedan caber fácilmente a través de una punta de pipeta de un mililitro girando la placa según sea necesario para que todos los tejidos se pican uniformemente.
A continuación, transfiera los fragmentos en tres mililitros de medio de digestión en un solo pozo de un plato de adhesión baja de seis pozos durante 14 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A la mañana siguiente, pipetee suavemente los tejidos 10 veces con una micropipeta de un mililitro y transfiera los fragmentos de tejido a un tubo de 15 mililitros. Recoger el tejido por centrifugación y resuspend el pellet en cinco mililitros de DPBS fresco.
Filtrar la suspensión a través de un colador de células de nylon pre-húmedo de 70 micrómetros, enjuagando el tubo en el colador cuatro veces con 10 mililitros de 37 grados Celsius DMEM-F12 por lavado. Para liberar los fragmentos de tejido, sostenga la pestaña del colador con los dedos engumétricos e invierta el colador sobre un plato de cultivo de tejido de 60 milímetros. Pasar cuatro alícuotas de un mililitro de medio de mantenimiento a través de la parte inferior del colador y examinar rápidamente el plato en busca de células individuales, gotas de grasa y tejido contaminante bajo un microscopio invertido.
A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas para permitir que los fragmentos de tejido se adhieran al plato y generen fragmentos bicapados. Para separar las células mioepteliales de las células epiteliales luminales, enjuague el plato con un mililitro de DPBS antes de añadir un mililitro de 0,5% de tripsina-EDTA fresca a las células. Supervise cuidadosamente la digestión bajo un microscopio invertido.
La capa externa de las células mioepteeliales comenzará a desprenderse en tres a seis minutos. Cuando las células mioepteliales se hayan desprendido, transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de 10%FBS en DPBS. Sin alterar las células epiteliales luminosas, enjuague suavemente el plato con dos mililitros de DPBS antes de añadir un nuevo mililitro de trippsina-EDTA a las células restantes.
Después de siete a 15 minutos, apagar la reacción enzimática con dos mililitros de 10%FBS en PBS y transferir las células a un nuevo tubo de 15 mililitros. Es fundamental monitorear de cerca las células durante la tripinación diferencial y no digerir en exceso las células. Cuando se hayan recogido ambas fracciones, centrifugar las células para eliminar cualquier reactivo de disociación residual y resuspender los pellets en 250 microlitros de medio de mantenimiento por tubo.
Después de contar, diluir cada población celular a un 1,2 veces 10 a las cuatro células por concentración de pozo en medio de mantenimiento fresco. Añadir 90 microlitros de 50%matriz extracelular en DMEM-F12 sin fenol rojo a cada pozo de un portaobjetos de ocho pozos. Cuando todos los pozos hayan sido recubiertos, solidifique la capa base en la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos.
Durante esta polimerización, recoger las fracciones celulares por centrifugación y resuspender cada población en 100 microlitros de 10%matriz extracelular en 90%medio de crecimiento por pozo. A continuación, agregue 100 microlitros de cada suspensión celular a cada pozo y permita que los co-cultivos se asientan durante 20 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, agregue cuidadosamente 100 microlitros de medio de crecimiento por el lado de cada pared de la cámara y devuelva el portaobjetos a la incubadora de cultivo celular.
I imagen de las células cada 24 horas para realizar un seguimiento de su crecimiento y renovar suavemente el medio de crecimiento cada dos o tres días. Para fijar los organoides para la inmunomancha, en el punto de tiempo experimental adecuado, aspirar cuidadosamente el medio de cada diapositiva para ser imagee y enjuagar cada pozo con 200 microlitros de DPBS por pozo. Fijar los organoides con 200 microlitros de paraformaldehído de cuatro grados Celsius durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de tratar los organoides con 200 microlitros de 0,2% de glicina en DPBS por pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, permeabilizar los organoides con 0.25%tritón X-100 en DPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido por el bloqueo de la unión no específica con 5%suero de burro o el suero apropiado que coincide con las especies del anticuerpo secundario en DPBS durante una hora con balanceo. Luego etiquete las células con 125 a 200 microlitros de los anticuerpos primarios apropiados de interés en el suero de 1%burro en DPBS durante la noche a cuatro grados Celsius con balanceo. A la mañana siguiente, lave cada pozo dos veces con 200 microlitros de DPBS más tritón X-100 antes de etiquetar los organoides con los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia apropiados durante 45 minutos a temperatura ambiente con balanceo protegido de la luz.
A continuación, lave cada pozo dos veces con DPBS fresco más tritón X-100 como se ha demostrado e imagine los organoides por microscopía de fluorescencia de acuerdo con los protocolos estándar. Después de 24 horas de incubación, los fragmentos epiteliales purificados se adhirieron al fondo del plato de cultivo formando estructuras planas similares a panqueques con una capa externa de células mioepteliales que rodean una capa interna de células epiteliales luminales. El tratamiento de la trippsina separa diferencialmente las células con las células mioepteliales que se separan primero y aparecen como células redondeadas brillantes que rodean el núcleo de las células epiteliales luminales cuboidales restantes.
La pureza general de los dos compartimentos celulares es de aproximadamente 90%, según lo evaluado por la expresión de queratina-14 y E-cadherina dentro de las dos poblaciones. Después de 10 días de cultivo en matriz extracelular al 10% sobre una base de matriz extracelular del 50%como se demostró, los organoides celulares epiteliales mioeptelialales formaron grandes estructuras ramificadas con lúmenes bien desarrollados. La diferenciación en el quinto día con la adición al medio de alveologénesis induce la formación de organoides que contienen leche más grandes y ramificados.
Es importante recordar lavar el colador cuidadosamente al recoger el epitelio para asegurarse de que no haya contaminantes estromales. Para consultar los cambios en la expresión génica, los investigadores pueden recoger el ARN de los organoides liberándolos de la matriz extracelular utilizando una solución de recuperación. El paraformaldehído se considera peligroso y los investigadores deben utilizar equipos de protección personal y trabajar dentro de una campana de humo cuando se utiliza este reactivo.
