우리의 프로토콜은 수지상 세포에서 HSV-1 유도 된 자가 회전율을 효율적으로 방해하는 방법을 설명합니다. 그리고 특히, 우리는 감염 전에 자가phagy를 차단하는 siRNA 기반 전략과 억제제 기지를 비교합니다. autophagy에 대한 억제제 기반 간섭은 잠재적이고 특정 오프 타겟 효과를 포함하지만, 당사의 개발된 siRNA 기반 전략은 더 표적 특이적입니다.
중요한 것은, 제시된 둘 다 기술 모두 질병의 성숙 단계에 영향을 미치지 않습니다. 절차를 시연하는 것은 기술자인 페트라 뮬 주르베스와 졸업생알렉산드라 두트호른이 제 실험실에서 볼 수 있습니다. 4일째에 세포 배양 물가의 바닥에서 느슨하게 부착된 세포를 부드럽게 헹구어 미숙한 수지상 세포 또는 iDC를 수확하는 것으로 시작합니다.
성숙한 수지상 세포 또는 mDC를 생성하기 위하여 세포에 성숙 칵테일을 추가합니다. 성숙의 유도 후 이틀 후, 세포 배양 플라스크의 바닥에서 mDC를 헹구는 다. 헹구기를 두 번 반복한 다음 iDC및 mDC를 각각의 배양 배지에서 50밀리리터 튜브로 옮기습니다.
원심분리를 통해 5분간 300배 g에서 세포를 수확한다. 셀 배양 플라스크당 RPMI 1640의 5~10밀리리터에서 세포를 부드럽게 재보중단하고 각각의 DC 서스펜션을 하나의 튜브에 결합한다. 그런 다음 쿼드를 처리할 때 온도 변화를 피하기 위해 계수 챔버를 사용하여 세포를 정량화합니다.
200만 개의 iDC 또는 mDC를 2밀리리터 튜브로 옮기고, 원심분리기는 3, 390배 g에서 1-1/2분 동안 1-1/2분 동안 폐기하고, 상부를 폐기한다. 부드럽게 감염 배지에서 세포를 다시 중단. 감염 1시간 전에 감염 배지에 10개의 마이크로몰어 스패우틴-1 또는 1개의 마이크로몰어 바필로마이신 A1을 추가하여 자가식 리소소말 분해 경로를 억제한다.
처리되지 않은 제어를 위해 DMSO를 추가하고 300 RPM에서 흔들림과 섭씨 37도에서 가열 블록에 세포를 배양. 감염 연구를 위해, 2의 감염의 복합성에 HSV-1 비정으로 세포를 접종하십시오. 모의 컨트롤로 MNT 버퍼의 각각의 볼륨을 추가하고 흔들림과 함께 1 시간 동안 섭씨 37도에서 가열 블록에 세포를 배양.
감염 후 1시간 후, 원심분리를 통해 세포를 3-1/2분 동안 390배, 390배g에서 수집한 다음 무접종을 부드럽게 흡인시키고 DC 배지의 세포를 재보종한다. 종자 모의 치료 및 HSV-1 6 웰 플레이트로 밀리리터 당 백만 세포의 최종 농도에서 HSV-1 감염 된 세포. 감염 후 16~24시간에서 세포 스크레이퍼 또는 mDC를 사용하여 iDC를 수확하여 헹구고, 세포를 1.5 밀리리터 안전 잠금 튜브로 옮기고 1-1/2 분 동안 3, 390 회 g에서 원심분리를 통해 수집하십시오.
우물에 남아있는 세포와 수확 및 원심 분리를 반복한 다음 PBS의 1 밀리리터로 펠릿을 한 번 씻고 용해 믹스에서 세포를 적극적으로 재보힙합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 10분간 배양한 다음 10분 동안 섭씨 95도까지 가열합니다. LC3B1 및 LC3B2, P62, ICP0 및 ICP5 및 GAPDH 단백질 수준을 확인하기 위해 SDS 페이지 및 서부 블롯 분석을 수행합니다.
3.5 포스트 준수일에는 1,200만 개의 iDC를 50밀리리터 튜브로 옮기고, 원심분리기를 5분 동안 300배 g로 옮긴 다음, 상부범을 폐기합니다. 병렬로 흐름 세포 측정 분석을 수행하여 성숙 상태를 모니터링합니다. iDC를 옵티-MEM 5밀리리터로 부드럽게 세척하고 페놀 레드와 원심분리기 없이 5분간 300배 g로 씻어냅니다.
100 마이크로리터 당 6백만 개의 세포로 세포 농도를 조정하는 Opti-MEM의 200 마이크로리터에서 상체를 폐기하고 세포를 재중단합니다. FIP200 특이적 또는 스크램블 된 siRNA 75 피코몰을 4 mm 전기 검사에 추가하고 각각의 큐벳으로 세포 서스펜션의 100 마이크로 리터를 전송합니다. 전기 기화 장치를 사용하여 iDC를 직접 펄스.
전기기분기 후 iDC를 신선한 미리 데운 DC 배지로 6웰 플레이트로 옮기고, 밀리리터당 100만 개의 세포가 최종 농도로 세포를 파종하고 인큐베이터에 넣습니다. 48 시간 후에, 전기 화 된 iDC의 형태를 현미경으로 검사한 다음 세포 스크레이퍼로 세포를 수확하고 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 0.1%EDTA로 보충된 PBS의 1밀리리터로 우물을 헹구고 용액을 각 튜브로 이송합니다.
그런 다음 원고에 설명된 바와 같이 각 siRNA 상태에 대한 세포를 분할합니다. 500, 000 세포를 사용하여 성숙 상태 및 세포 생존 가능성을 평가하고, FIP200 특이적 녹다운 효율을 확인하고 HSV-1 감염 실험에 남은 세포를 사용하기 위해 서부 얼룩 분석을 위해 백만 개의 세포를 사용합니다. 생성된 iDC 및 mDC는 다른 세포 유형과의 오염을 배제하고 성숙 상태를 확인하기 위해 유동 세포측정에 의해 전형적으로 분석되었다.
세포는 각각 T 세포 및 단세포 오염을 배제하기 위해 CD3 및 CD14 항체로 염색되었다. 세포는 CD에 대해 높게 발현된 일반 마커 역할을 하는 CD11c를 위해 염색되었다. 성숙 상태를 평가하기 위해, CD80, CCR7, CD83 및 MHCII 항체는 이러한 분자가 성숙한 DC에 높게 발현되기 때문에 사용되었다.
형광 현미경 검사법과 유동 세포측정은 HSV-1을 발현하는 EGFP를 이용한 감염을 결정하는 데 사용되었다. 강력한 GFP 신호는 iDC 및 mDC의 거의 완전한 감염을 나타냅니다. 서양 얼룩 분석은 HSV-1 감염된 세포에서 스패틴-1 또는 바필로마이신 A1이 자가변플록을 억제하는지 여부를 결정하는 데 사용되었다.
iDC에서, 자가플럭스는 각각 스파우틴-1 및 바필로마이신 A1의 부재시 P62 및 LC3B 발현의 감소에 의해 입증된다. 대조적으로, 스패틴-1의 부재에 있는 mDC의 HSV-1 감염은 P62 발현에 영향을 미치지 않으며 spautin-1 및 BA1 처리는 자기phagy의 유도를 반영하는 LC3B-II의 축적을 유도하지만 mDC에서 자동 회전율의 실패를 유도합니다. siRNA 전기화로 FIP200 단백질 수준을 감소시키는 것은 또한 HSV-1 감염된 iDC에 있는 자기 측량에 있는 강한 감소를 일으키는 원인이 됩니다.
자가식의 억제를 위한 이러한 siRNA 기반 전기포기 프로토콜은 iDC에서 세포 생존, 이미지 표현형 또는 HSV-1 단백질 발현의 확립에 영향을 미치지 않는다. 우리의 전기 기화 프로토콜은 질병 및 그밖 1 차적인 세포 모형으로 뚜렷한 DNA 또는 RNA 종을 전달할 기회를 제공합니다. 이어서 다양한 분자, 기능적 및 감염 분석을 수행할 수 있다.
질병에 있는 표현 침묵을 위한 siRNA 기지를 둔 전략은 또한 후속 기능적인 분석과 결합된 관심있는 어떤 단백질든지의 기능을 탐구하는 쪽을 포장합니다.
