Name: differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line
Uploaded: 2016-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
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We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

1. 일반 고려 사항 <ol><li> 필요한 시약의 목록을 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 엄격한 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> FBS를 포함하는 모든 미디어 준비에 대한 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (hiFBS)를 사용합니다. 열 - 불 활성화, 10 분마다 반전, 30 분 동안 56 ° C에서의 FBS 50 ㎖ 분취 량을 따뜻하게 (또한하기 표 1 참조). 주 : FBS가 열 불 활성화없이 사용하는 경우에는, 상피 같은 표현형 SH-SY5Y 세포의 배양에 걸쳐보다 빠르게 진행한다. </li><li> 사용하기 전에는 미디어가 따뜻하게 모든 단계 전에 적절한 산도 균형을 설정하는 인큐베이터에서 평형 수 있습니다. 예를 들어, 매체의 50 ㎖ 완전히 평형을 약 1 시간 소요 (pH가 7, 37 ° C, 5 % CO 2). 주 :이 프로토콜은 트립신 처리하고 다시 도금 될 편미분 SH-SY5Y 세포를 필요로하는 두 단계의 분리 방법을 사용한다. 이것은 스트레스이러한 매우 깨지기 쉬운 세포에 대한 처리. 따라서, 최소의 시간 트립신에 세포를 배양 중요하다. 이것은 여전히​​ 접시에 부착 된 상피 - 유사 세포를 떠나, 신경 세포의 특혜 리프트 오프 (lift-off)를 허용합니다. </li><li> 서서히 세포를 함유하는 원뿔형 튜브의 바닥에 대해 팁 10 ㎖ 플라스틱 피펫으로 분화 된 세포의 분쇄를 수행한다. 상하 더 느린 속도로 다섯번 이상 분쇄를 수행한다. </li></ol> SH-SY5Y 유지 관리 문화의 2. 통과 <ol><li> 세포를 70-80 %의 컨 플루 언시에 도달하고, 10 ~ 15 유로를 초과하지 않는 분리 유지 배양. 문화는 일반적으로 (가정 문화가 분할 동안 5 배 이상 희석되지 않음) 모든 3-5일를 계대 할 필요가있다. </li><li> T-75 플라스크에서 통과 셀에 다음 PBS 1X 약 10 ㎖로 씻어, 미디어를 대기음. 참고 : 우리는 SH-SY5Y 유지 보수 문화 쿵푸을 분할하지 않는 것이 좋습니다1보다 rther : 5 계대 동안이 세포가 낮은 컨 플루로 인해 사망 원인이 될 수 있기 때문이다. </li><li> 대기음 PBS는 다음 2.5 ml의 0.05 % 트립신 - EDTA (1 배)를 추가합니다. </li><li> 배양기에서 2-3 분 인큐베이션하고 플라스크의 표면으로부터 세포를 분리 부드럽게 팁. </li><li> 10 ml의 기본 성장 미디어 추가 (표 2 참조) 및 1-2 번 씹다. </li><li> 1,000 XG에서 2 분 동안 스핀 다운, 흡인 미디어 다음, 5 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛을 재현 탁. </li><li> T-75 플라스크에서 일반 도금 20 ML의 총 부피 5, 또는 분화 (섹션 5)에 대한 계산과 판 : 1 ~ 3 : 1에서 세포를 희석. </li></ol> 3. 냉동 SH-SY5Y 세포 <ol><li> 5 % (v / v)의 DMSO 보충 된 기본 배지에서 성장 SH-SY5Y 세포의 신경 아세포종 초기 통로 동결. </li><li> 처음 24 시간 동안 -80 ℃에서 분취 액을 동결 한 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 옮긴다. 주 : 참고로 합류 (75~85%)를 T-75 플라스크에 다섯 수득 할냉동 SH-SY5Y 세포를 1 ml의 분취. 이 분취 액의 각각은 총 어디서나 2-5000000 세포를 포함해야합니다. </li></ol> 4. 해​​동 문화 미분화 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포 <ol><li> 기본 성장 미디어를 준비합니다. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조 (약 2 분)에 동결 된 세포를 해동. </li><li> 15ml의 원뿔형 튜브에서 9 ㎖의 기본 성장 배지에서 세포를 재현 탁하고, 그 다음 1000 x g에서 2 분간 원심 분리. </li><li> 기음 뜨는 10 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛 세포, 부드럽게 재현 탁 세포를 방해하지 않도록주의하면서. </li><li> T-25 플라스크 또는 60mm 2 접시 위에 플레이트 세포. </li><li> 다음 날, 죽은 세포를 제거하기 위해 미디어를 교체합니다. </li></ol> 5 일 0 : 차별화에 대한 도금 세포 <ol><li> 차별화 일정 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 1X PBS, 대기음으로 미분화 세포를 씻어 후 1-2 ml를 따뜻하게 사용하여를 Trypsinize1 배 0.05 % 트립신 - EDTA. </li><li> 세포가 트립신에있을 때, 인큐베이터에서 약 3 분 동안 품어. </li><li> 10 ml의 기본 성장 미디어를 추가하여 트립신을 해소 플라스크 또는 접시의 측면을 씻어 부드럽게 1-3 번 씹다. 15 ML 원뿔 튜브에 내용을 전송합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 1,000 XG에 2 분 동안 원심 분리기, 그리고 미디어를 대기음. </li><li> 재현 탁의 5 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛과 1-3 번 씹다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산 한 다음 / ㎖ 50,000 셀에 기본 성장 미디어를 사용하여 희석. </li><li> 접시 2 접시 당 10 만 셀의 총 35mm 2 접시 당 세포 ㎖의 인큐베이터에 다시 배치합니다. </li></ol> 6. 1 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1) <ol><li> 분화 매체 # 1 분취 액 50 ㎖를 (표 2 참조)를 37 ℃의 수조에서 배양한다. </li><li> 미디어가 가온되면 (이것은 인큐베이터 평형 37 있도록° C는 5 % CO 2) 적어도 하나의 시간 동안 사용하기 전에 적절한 산도 균형을 확립한다. </li><li> 레티노 산 (RA)를 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조). 참고 : 레티노 산 민감한 빛과 4 ° C에서 어두운 병에 보관해야합니다 </li><li> 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다. </li><li> 35mm 2 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 1을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. </li></ol> 7. 3 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1) <ol><li> 반복 섹션 6 (1-5 단계) </li></ol> 8. 5 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1) <ol><li> 반복 섹션 6 (1-5 단계) </li></ol> 9 일 7 : 분할 세포 1 : 1 <ol><li> RA는 따뜻하게 추가하고 즉시 요리에 미디어를 추가하기 전에 차별화 미디어 # 1 평형. </li><li> 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다. </li><li> 200 μl를 추가35mm 2 접시 당 0.05 % 1X 트립신 EDTA를 따뜻하게 약 2 ~ 3 분 또는 셀까지가 눈에 띄게 현미경으로 관찰 판에서 해제되는 인큐베이터 따뜻한. </li><li> 35mm 2 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 1을 추가하여 트립신을 끄다 플레이트 떨어져 신경 세포 남은 린스 미디어를 사용합니다. 그런 다음 50 ㎖ 원뿔 관에 내용을 전송합니다. 참고 : 트립신 단계 동안, 한 번에 너무 많은 요리를 Trypsinize하지 않습니다. 이 세포 독성이 될 수있는 연결을 문화가 너무 오래 트립신 배양되지 않도록하는 데 도움이됩니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 최대 10 요리에서 내용을 결합하고 부드럽게하고 더 이상 5 배 아래로 10 ml의 플라스틱 피펫으로 천천히 씹다. </li><li> 나누어지는 2 ml의 세포 신선한 35mm 2 요리에 매달리기와 인큐베이터로 돌아갑니다. </li></ol> 10 일 8 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 2) <ol><li> RA를 추가합니다 (&lt;강한&gt; 표 1) 가온 즉시 요리에 미디어를 추가하기 전에 미디어를 평형합니다. </li><li> 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다. </li><li> 천천히 2 mL의 차별화 미디어 # 2 (표 2 참조) 추가 35mm 2 접시와 인큐베이터에 반환 당 RA와. 허용하지 않음 뉴런은 빨리 건조 수 장기간 공기에 노출된다. </li></ol> 11 일 9 : 세포 외 기질 (ECM)를 준비 코팅 요리 <ol><li> 얼음에 ECM 솔루션 중 하나 병을 해동 1을 희석 : 100 차가운 DMEM으로. </li><li> 각 35mm 2 접시에 혼합 2 ㎖를 분배하고 접시의 전체 염기가 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 인큐베이터에있는 장소 (37 ° C, 5 % CO 2) 1 시간 또는 하룻밤합니다. </li><li> 기음 혼합물과 후드에서 약 1 시간 동안 공기 건조에 있습니다. 최대 2 개월 동안 실온에서 보관. </li></ol> 12 일 10 : 전송 세포 상ECM 코팅 된 플레이트 1 : <ol><li> RA 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조). </li><li> 조심스럽게 미디어를 대기음 및 폐기합니다. </li><li> 각 35mm 2 접시에 트립신 가온 200 μl를 추가하고 약 1-2 분 동안 또는 신경 세포가 눈에 띄게 현미경으로 관찰 접시에서 해제 될 때까지 실온에서 배양 할 수 있습니다. 주 : 트립신 뉴런 오버 부화 손상하지 않도록하고 실온이 트립신 처리 단계를 실행한다. 뉴런은이 단계에서 상피 - 같은 세포보다 훨씬 빠른 판에서 놓습니다. </li><li> 35mm 2 접시 당 2 ml의 차별화 미디어 # 2를 추가하여 트립신을 해소하고, 플레이트 떨어져 신경 세포 남은 린스 미디어를 사용합니다. 그런 다음 50 ㎖ 원뿔 관에 내용을 전송합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 최대 10 요리에서 내용을 결합하고 부드럽게 위로와 함께 더 이상 5 배 아래로 천천히 씹다10 ml의 플라스틱 피펫. </li><li> ECM 코팅 35mm 2 요리에 2 ㎖의 세포 현탁액을 분배하고 인큐베이터로 돌아갑니다. </li></ol> 13 일 11 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 3) <ol><li> RA 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조). </li><li> 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다. </li><li> 천천히 35mm 2 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 3 (표 2 참조) 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 허용하지 않음 뉴런 장기간 공기에 노출된다. </li></ol> 14 일 14 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 3) <ol><li> 반복 섹션 13 (1-3 단계) </li></ol> 15 일 17 : 마지막 미디어 변경 (차별화 미디어 # 3) <ol><li> 반복 섹션 13 (1-3 단계) </li></ol> 16 일 18 : 사용 준비 신경 문화 <ol><li> 신선한의 Diff 미디어 변경3 일마다 RA와 erentiation 미디어 # 3는 신경 세포의 건강을 유지합니다. 세포가 신경 세포로 분화되어야하며, 신경 세포 표현형을 나타내는 참고. 배양 단말 분화 다음 최대 14 일 동안 일반적으로 안정, 신경 세포 생존을 지속하지만 분화의 시작에서 미분화 세포의 통과 횟수에 의존한다. 높은 통로 번호는 더 짧은 유효 수명 차별화 뉴런을 얻었다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

위의 프로토콜은 균일하고 가능한 인간의 신경 세포 문화를 생성하는 간단하고 재현성있는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 기술과 각각의 모범 사례를 서술하는 데 몇 이전에 발행 된 방법 1-4과 목표를 통합하는 방법을 사용합니다. SH-SY5Y 세포의 분화는 점진적으로 혈청 부족에 의존; 레티노 산, 향 신경성 인자 및 세포 외 기질 단백질의 첨가; 시리얼 분할 차별화 성숙한 부착 뉴런 선택...

시험 관내 모델 시스템에 사용하는 능력은 크게 신경 생물학 및 신경 과학 분야를 강화하고있다. 배양 세포가 감염 질병의 병리를 이해하고, 예비 약물 시험 평가를 수행하는 단백질의 기능 및 분자 기전 특정 현상을 특징 효율적인 플랫폼을 제공한다. 신경 생물학에서 세포 배양 모델의 주요 유형은 쥐 B35 세포 5 신경 2A 마우스 세포 6, 랫트 PC12 세포는 7 쥐 및 신경 아세포종 세포주 유래의 주요 신경 배양 물을 포함한다. 이러한 세포주의 사용이 크게 필드 진행 하였지만, 비 - 인간 세포 및 조직 처리와 연관된 여러 교란 요인이있다. 인간과 비교했을 때 이러한 이해 종 특이 대사 과정의 차이, 질병 증상 및 발병 기전의 표현형을 포함한다. 이 점에 유의하는 것이 중요하다설치류 모델 제약 경로는 설치류와 인간 사이에서 보존되는 8-11 이해 중요성 강조 마우스 및 인간의 유전자 발현 및 전사 인자 신호 사이에 상당한 차이가 다시한다. 기타 N-테라 -2- (NT2) 인간 기형 암종 세포주 유도 성 및 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 신경 세포 라인의 사용을 채용 하였다. 이 세포주는 체외 인간의 시스템에 대한 좋은 모델을 제공합니다. 그러나, 레티노 산 (RA) 신경 교세포의 혼합 집단의 생성을 초래하고 추가의 정제 공정을 필요 반경 신경교 세포 (12)와 NT2 세포의 분화 신경 세포 집단을 순수 얻었다. 또한 NT2 세포는 세포의 72 %보다 큰 60 염색체와 매우 가변적 핵형 13 보여준다. iPSCs는 다른 세포 라인 사이의 차별화에 다양성을 보여 분화 효율에 차이가<html> 14. 이들 대안을 편안하게 일관되고 재현 인간 신경 세포 모델을 갖는 것이 바람직하다. SH-SY5Y의 neuroblast 같은 세포는 부모의 신경 모세포종 세포주 SK-N-SH의 서브 클론입니다. 부모 세포주 neuroblast 같은 상피 세포 형 (15)을 모두 포함하는 골수 생검 1970에서 발생 하였다. SH-SY5Y 세포를 47 염색체 이루어진 안정한 핵형을 가지고, 다른 RA의 사용을 포함하는 메커니즘, 포르 볼 에스테르 및 뇌 유래 특정 뉴로 통해 다양한 성숙한 인간 뉴런에 neuroblast 같은 상태로부터 구별 될 수있다 신경 영양 인자 (BDNF). 선행 증거는 다른 방법의 사용은 아드레날린, 콜린성 및 도파민 뉴런 16,17 특정 신경 세포 아형에 대해 선택할 수있는 제안한다. 이 후자의 측면은 신경 생물학 실험의 다수 유용 SH-SY5Y 세포를 만든다. ontent는 &quot;&gt; 여러 연구는 미분화와 차별화 된 지역에서의 SH-SY5Y 세포 사이의 중요한 차이점을 지적했다. 때 SH-SY5Y 세포는 미분화, 그들은 빠르게 증식과 거의 짧은 프로세스와, 비 편광 것으로 보인다. 그들은 종종 성장 분화시 미성숙 뉴런 18,19 나타내는 덩어리 및 발현 마커. 이러한 세포는 긴 분지 프로세스 증식의 저하를 확장하고, 어떤 경우에는 2,18을 편광. 완전히 분화 ​​된 SH-SY5Y 세포는 이전에 표현하는 것으로 입증되었다 성장 관련 단백질 (GAP-43), 신경 핵 (NeuN), synaptophysin에 (SYN), 시냅스 소포 단백질 II (SV2), 신경 세포 특이에 놀라 (NSE)와 미세 소관 연관 단백질 (MAP)를 포함하여 성숙한 신경 세포의 다른 마커의 다양한 2,16,17,20, 이러한 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 4 등의 폐해 마커의 발현을 부족합니다. SH-SY5Y 세포가 represe 차별화 추가 지원에NT 균질 신경 인구 BDNF를 제거하여 세포 사멸 4 초래한다. 이는 차별화 된 SH-SY5Y 세포의 생존 신경 세포를 성숙 비슷한 영양 요인에 따라 달라집니다 것이 좋습니다. 서브 클론 1978 3 년에 설립 된 이후 SH-SY5Y 세포의 사용은 증가하고있다. 그 사용의 예는 파킨슨 병 (17), 알츠하이머 병 (21), 및 폴리오 바이러스 (22), 엔테로 바이러스 71 (EV71)를 포함하는 바이러스 감염의 병인 (23, 24)을 조사 포함 수두 - 대상 포진 바이러스 (VZV) 1, 인간 거대 세포 바이러스 (25), 및 단순 포진 바이러스 (HSV) 2,26. 특히 neurovirology 27-36 분야, SH-SY5Y 세포는 미분화 형태로 이들 세포를 사용하여 한 것을 여러 연구가 중요하다. 분화 된 SH-SY5Y 세포에 비해 미분화 관찰 된 표현형의 차이 whe에 의문을 제기THER 감염의 진행을 관찰 성숙한 분화 된 신경 세포에서 상이한 것이다. 예를 들어, 분화 된 SH-SY5Y 세포에 의한 HSV 결합 미분화 SH-SY5Y 세포를 2 엔트리를 변조 표면 수용체의 부족 일 수있다 분화, 증식 SH-SY5Y 세포, 대 HSV-1 흡수 높은 효율을 갖는다. 이는 시험관 내에서 신경 세포를 테스트에 초점을 맞춘 실험을 설계 할 때, SH-SY5Y 세포를 생체 내 모델로 변환하고 비교에 대한 가장 정확한 결과를 얻기 위하여 구별되어야 함 때문에 중요하다. 인간 신경 세포 배양 물을 생성하는 신뢰할 수있는 방법의 개발이 연구 정확하게 인간 신경계 병진 모델 실험을 수행 할 수 있도록하는 것이 필수적이다. 여기에 제시된 프로토콜은 차별화되는 인간의 신경 세포에 대한 풍부 이전의 방법 1-4에서 파생 된 모범 사례를 묘사 절차레티노 산을 사용.

<table><tbody><tr><td>B-27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>Sigma</td><td>SRP3014 (10 &amp;mu;g)/B3795 (5 &amp;mu;g)</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)</td><td>Sigma</td><td>M5650</td><td>-</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>GlutamaxI</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>-</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>-</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution</td><td>Sigma</td><td>E0282</td><td>See step 11 of the protocol</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>-</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>-</td></tr><tr><td>Retinoic acid (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Should be stored in the dark at 4 &amp;deg;C because this reagent is light sensitive</td></tr><tr><td>SH-SY5Y Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>-</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin + EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td>-</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC dishes</td><td>Falcon (A Corning Brand)</td><td>353001</td><td>-</td></tr></tbody></table>

differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

현재, 이러한 흡수되어 최적 바이러스 2와 같은 획일적 인 SH-SY5Y 세포는 중요한 미분화 세포가 부족할 수 인간 뉴런 27-36, 표현형 및 기능에 대한 모델로서 사용되는 신경 생물학 및 neurovirology 분야의 많은 경우가있다 정확한 해석을 위해 필요한. 이 체외 신경계를 SH-SY5Y 세포를 사용하거나 다른 어떤 경우에는, 세포가 적절하게 생체 내에서 뉴런에서 발생 될 것인가의...

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Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

71.4K 조회수.  The Pennsylvania State University. It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications. 

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Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

연구

발생학

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

절연, 강화하고, Medulloblastoma의 줄기 세포의 유지 보수

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

신경과학

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median survival following diagnosis is less than 15 months with maximal surgical resection, radiation, and temozolomide chemotherapy. The challenges inherent in developing more effective GBM treatments have become increasingly clear, and include its unyielding invasiveness, its resistance to standard treatments, its genetic complexity and molecular adaptability, and subpopulations of GBM cells with phenotypic similarities to normal stem cells, herein referred to as glioblastoma stem cells (GSCs). Because GSCs are required for tumor growth and progression, differentiation-based therapy represents a viable treatment modality for these incurable neoplasms. 
The following protocol describes a collection of procedures to establish a high throughput screening platform aimed at the identification of small molecules that promote GSC astroglial differentiation. At the core of the system is a glial fibrillary acidic protein (GFAP) differentiation reporter-construct. The protocol contains the following general procedures: (1) establishing GSC differentiation reporter lines; (2) testing/validating the relevance of the reporter to GSC self-renewal/clonogenic capacity; and (3) high-capacity flow-cytometry based drug screening. 
The screening platform provides a straightforward and inexpensive approach to identify small molecules that promote GSCs differentiation. Furthermore, utilization of libraries of FDA-approved drugs holds the potential for the identification of agents that can be repurposed more rapidly. Also, therapies that promote cancer stem cell differentiation are expected to work synergistically with current "standard of care" therapies that have been shown to target and eliminate primarily more differentiated cancer cells.

An efficient screening protocol is presented for the identification of small molecules that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells (GSCs). The assay is based on a stem cell differentiation reporter whereby the expression of the enhanced GFP (eGFP) is driven by the human GFAP promoter.

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

암 연구학

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, recent evidence indicated that Tau is present also in other subcellular compartments including the nucleus where it is implicated in DNA protection, in rRNA transcription, in the mobility of retrotransposons and in the structural organization of the nucleolus. We have recently demonstrated that nuclear Tau is involved in the expression of the VGluT1 gene, suggesting a molecular mechanism that could explain the pathological increase of glutamate release in the early stages of Alzheimer&#39;s disease. Until recently, the involvement of nuclear Tau in modulating the expression of target genes has been relatively uncertain and ambiguous due to technical limitations that prevented the exclusion of the contribution of cytoplasmic Tau or the effect of other downstream factors not related to nuclear Tau. To overcome this uncertainty, we developed a method to study the expression of target genes specifically modulated by the nuclear Tau protein. We employed a protocol that couples the use of localization signals and the subcellular fractionation, allowing the exclusion of the interference from the cytoplasmic Tau molecules. Most notably, the protocol is easy and is composed of classic and reliable methods that are broadly applicable to study the nuclear function of Tau in other cell types and cellular conditions.

Tau is a neuronal protein present both in the cytoplasm, where it binds microtubules, and in the nucleus, where it exerts unconventional functions including the modulation of Alzheimer&#39;s disease-related genes. Here, we describe a method to investigate the function of nuclear Tau while excluding any interferences coming from cytoplasmic Tau.

질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

유전학

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models is crucial both to better understand the pathological mechanisms of these diseases and identify new therapeutic targets and strategies. To be pertinent, an in vitro model must reproduce the pathological features of a human disease. However, in the context of neurodegenerative disease, a relevant in vitro model should provide neural cell replacement as a valuable therapeutic opportunity. 
Such a model would not only allow screening of therapeutic molecules but also can be used to optimize neural protocol differentiation [for example, in the context of transplantation in Parkinson's disease (PD)]. This study describes two in vitro protocols of 1) human glioblastoma development within a human neural organoids (NO) and 2) neuron dopaminergic (DA) differentiation generating a three-dimensional (3D) organoid. For this purpose, a well-standardized protocol was established that allows the production of size-calibrated neurospheres derived from human embryonic stem cell (hESC) differentiation. The first model can be used to reveal molecular and cellular events occurring during in glioblastoma development within the neural organoid, while the DA organoid not only represents a suitable source of DA neurons for cell therapy in Parkinson's disease but also can be used for drug testing.

This study introduces and describes protocols to derive two specific human neural organoids&#160;as a relevant and accurate model for studying 1) human glioblastoma development within human neural organoids exclusively in humans and 2) neuron dopaminergic differentiation generating a three-dimensional organoid.

뇌암과 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 인간의 신경 오르가노이드

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

생체공학

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

STED 현미경을 사용한 뉴런의 미토콘드리아 초세구조 규명

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 노화 해독 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...