이 프로토콜은 축소로텔에서 유전 검열에 사용될 수 있는 돌연변이된 haploid 사지의 생산을 허용합니다. haploids에서, 심지어 낮은 수준의 돌연변이 발생은 세포 내의 기능 표현형의 손실을 생성할 수 있습니다. 이 접목 기술은 또한 배아 치명적인 표현형을 구출하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 방법은 체외 수정 및 접목에 순종하는 모든 양용 종에서 재생을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. haploid 배아를 기증자로 사용하기 전에 GFP 양성 및 부정적인 디플로이드 배아 사이의 이식의 성공을 연습하고 확인하는 것이 좋습니다. 여성 게이머 기증자 준비를 위해, 성적으로 성숙한 흰색 또는 흰색 RFP 여성 axolotl을 마취하여 gamete 기증자로 봉사합니다.
통증 시뮬레이션에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 30 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 인간의 융기 생식선 인 성 생식샘을 뒷다리에 근육 에 0.15 밀리리터를 주입하십시오. 척수와의 접촉을 피하기 위해 주사기를 중간라인에 45도 각도로 삽입합니다. 주입된 동물을 신선한 40% Holtfreter용용으로 넣고 액졸로틀을 섭씨 8~12도의 냉장고로 48시간 동안 옮겨놓습니다.
그런 다음 여성을 실온으로 되돌려 보입니다. 암컷이 알을 낳는 동안, 해부 현미경 아래 젖은 종이 타월에 완전히 마취 된 남성을 배치하고 지배적 인 손으로 클로카의 기지에 P1000 파이펫의 끝을 배치합니다. 다른 에이핑거와 엄지손가락 2~3센티미터 로스트랄을 골반에 놓고 손가락을 뒷다리쪽으로 움직이면서 동물을 부드럽게 짜서 각 샘플을 새로운 미세원심심분리기 튜브로 채취한 정자 소변 샘플을 씻어냅니다.
그런 다음 각 샘플에서 5개의 마이크로리터를 페트리 접시로 옮겨 반전된 현미경을 사용하여 정자의 품질을 검사합니다. 카운트 후, 0.1X 멸균 MMR에서 밀리리터 당 네 번째 세포에 8 배 10의 농도로 정자를 희석하고 새로운 페트리 접시에 계란 당 정자 세포의 0.5 마이크로 리터를 전송. 그런 다음 파이펫 팁을 사용하여 서스펜션을 1mm 두께층으로 확산시키고 플라스틱 리프트를 사용하여 254 나노미터 크로스링커의 전구에서 4센티미터 떨어진 샘플을 밀리미터 제곱당 8회 10번에서 제곱당 5마이크로줄로 조사합니다.
건강한 정자 샘플을 수집 한 후, 젖은 종이 타월의 스택에 supine 위치에 여성을 배치하고 여성 axolotl에서 수정되지 않은 계란을 추출하는 유사한 홍조 운동을 사용합니다. 그런 다음 젖은 집게를 사용하여 계란을 10센티미터 페트리 접시로 옮기습니다. 수집 15 분 이내에 P10 파이펫을 사용하여 각 계란을 0.25 ~ 0.5 마이크로 리터의 불활성화 된 정자로 코팅하는 수정되지 않은 계란에 조사 된 정자를 분배하십시오.
계란이 30 분 동안 실온에 앉을 수 있게 한 후 계란을 0.1X MMR로 범람하십시오. 수분 후 30 분, 계란을 데젤리하 고 7 시간 이내에 미세 주입에 대 한 18 섭씨에 계란을 배치 날카로운 집게를 사용 하 여. haploid-diploid chimera를 생성하려면, 10섭씨 이하 의 수술 매체를 포함하는 사전 냉장 작동 접시의 트로프 안에 GFP 양성 디플로이드 호스트 배아와 하나 또는 두 개의 단계 일치한 1개의 건강한 haploid 기증자를 놓습니다.
두 개의 초미세 오토클레이브 스트레이트 팁 집게를 사용하여 사지 전체와 주변 외장 및 중피 조직 층을 제거하고 호스트 조직을 따로 둡니다. haploid 기증자에서 동등한 크기의 조직 칼집을 제거하고 호스트 태아의 해당 영역에 haploid 기증자 조직 칼집을 놓습니다. 분쇄 된 현미경 커버 글래스에서 자동 직사각형 유리 조각으로 조직을 고정하고 조직을 숙주 배아 몸으로 부드럽게 누릅니다.
덮개 유리 조각을 벗겨 포셉을 사용하기 전에 유리가 미끄러지지 않은지 확인하기 위해 20 분마다 60 ~ 75 분 동안 앵커를 둡니다. 이식된 배아를 신선한 수술 매체로 옮기면 12또는 24웰 플레이트에 개별적으로 이식된 배아를 수용하기 전에 하룻밤 사이에 섭씨 8~12도에서 치유할 수 있습니다. 38.7%의 난모세포가 정상적으로 발달된 haploid 배아로 발전했습니다.
접목 단계에서, haploid 배아는 전방 후방 축및 노른자 플러그의 불완전한 인클로저를 따라 감소된 곡률을 나타낸다. 또한, 형광 현미경은 haploid 배아가 친자 유래 GFP 발현이 없는지 확인하기 위해 사용될 수 있다. 실패하고 불순한 이식편은 다양한 표현형을 생성합니다.
이식편이 깨끗하고 일반적으로 개발될 때, GFP 발현은 주로 상반신 신경총, 숙주 척수에서 파생된 신경망으로 제한되어야 합니다. Punctate GFP 발현은 또한 개발 사지로 이동하는 혈액 유래 숙주 세포에 있는 감각 뉴런으로 나타나는 단 하나 세포에서 존재합니다. RFP 양성 기증자가 사용될 때, haploid 접목 사지는 RFP의 보편적인 표현을 전시합니다.
개발 전반에 걸쳐, 비 돌연변이 된 haploid 사지는 키메라 동물의 반대 디플로이드 앞다리보다 상당히 짧습니다. 비 돌연변이 된 haploid 사지는 완전히 재생, 비록 그들은 디플로이드에 비해 디지털 성장 단계에 도달에 약간의 지연을 보여줍니다. 멸균 기술을 사용하고 완전히 제거하고 깨끗하게 접목 된 사지를 생산하기 위해 배아 호스트에서 전체 중피 및 자궁 조직 층을 교체하는 것을 기억하십시오.
돌연변이 사지는 절단하고 재생 표현형을 위해 득점될 수 있습니다. 돌연변이 진상제는 차세대 시퀀싱으로 정량화될 수 있습니다. CRISPR-Cas9 돌연변이 발생과 결합하여, 우리의 이식 기술은 우리가 haploid 사지를 재생에 표적 유전자의 부정적인 선택 화면을 수행 할 수 있었습니다.
