이 작품은 보조금의 지원으로 수행 되었다 5R21HD080684-02, 아동 건강의 국가 학회 및 인간 발달에서. 저자 켄 조 그의 지속적인 열정과 지원에 대 한 감사를 기원 합니다. 저자 또한 싶습니다 원고, 숀 맥 나 마라와 국가 Xenopus 자원 (RRID:SCR_013731)에 마 Wlizla의 중요 한 독서에 대 한 그의 카메라, 리브가 Charney의 사용에 대 한 브루스 블 룸 베르크를 인정 하는 가치에 대 한 X. tropicalis 수 유 및 동물 관리 식이요법에 관한 대화.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용, Irvine가 주 대학의 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. PGC 식 위한 준비
<ol><li>앞에서 설명한23으로 해 부 도구를 사전에 준비 합니다. 참고: 눈 썹 머리 칼 수술을 수행 하는 동안 태아를 안정 시키기 위해 머리 루프의 도움으로 절 개를 만드는 데 사용 됩니다. 눈 썹 머리와 머리 루프 붕 규 산 유리 펫 파스퇴르는 화 염에 그려 왔다 처음으로 붙어 있으며 남았다 부분에 깨진 (참조 그림 1A, 화살촉) 큰 손 재주에 대 한 짧은, 좁은 팁 (그림 1B)를 만들 때 수술을 수행.</li>
	<li>SgRNAs 절차 이전 기술된24 을 사용 하 여 생성 합니다. 참고: 짧게, 짧은 DNA 서식 파일 sgRNAs에 대 한 코딩 만들어집니다를 오류-무료, thermostable DNA 중 합 효소 겹치는 deoxyoligonucleotides 5' 살 균 소 T7 발기인, 단련 되 고 "입력"를 포함 하 여. SgRNA 합성 반응 생체 외에서 (키트 사용)에 따라 하룻밤 몇 시간 동안 알을 품는. 반응은 DNAse 처리는 서식 파일을 제거 하는. sgRNAs 페 놀/클로 프롬 추출 및 암모늄 아세테이트/소 프로 파 놀 강수량, 키트 제조 업체의 지침24에 따르면의 표준 방법으로 정화 된다.</li>
	<li>Microinjections를 수행 하기 전에 곧 준비 Cas9 sgRNA 단지 첫 번째 변성 ~ 250 여 RNAse 무료 (diethylpyrocarbonate 대우) H2O 60-65 ° C에서 5 분의 3 µ L 전체 볼륨에서 sgRNA의 ng 뒤에 빠른 냉각 5 분 동안 얼음에. 몇 초 동안에 sgRNA 원심 1 µ g / µ L Cas9 단백질의 1 µ L을 추가 하 고 복잡 한 형성을 촉진 하는 37 ° C에서 10 분 동안 품 어. 참고:이 부 화에 따라 튜브 수 보관 얼음에 microinjection에 대 한 배아를 준비 하는 동안.</li>
	<li>X. tropicalis 배아 체 외에서 수정 표준 방법을 사용 하 여 앞에서 설명한25얻을. 01-25,26 젤리 10 분 후 수정에서 태아. 참고: 수정 시간 시간 후 정자 현 탁 액 계란에 추가 되 고 접시 1/9thX와 홍수입니다 간주 됩니다 마크의 Ringers 수정 (MMR)26. 1/9에 드 jellying X. tropicalis25, X. laevis, 달리 수행에 대 한 3% 시스테인 무료 자료 (하지 HCl 소금), 포함 된 x MMR pH 7.8-8.0, 조정 뒤에 1/9에 여러 세척 x MMR. Agarose (1%)에 배아를 전송-1/9를 포함 하는 코팅된 접시 실 온에서 x MMR.</li>
	<li>즉시 1 1 %agarose 코팅 접시에 주입 될 배아 전송 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 x MMR.</li>
	<li>
1 세포 단계에서 주입. Xenopus microinjection 방법에 대 한 자세한 설명에 대 한 참조26,27 를 참조 하십시오.
	<ol>
<li>4 동물 극에서 단일 사이트에 각 배아 주사 Cas9 sgRNA 복잡의 홀란트 (최종 금액 = 1 Cas9 및 sgRNA의 ~ 250 pg의 ng; 보십시오 토론)24. 사출 사이트 치유의 10-20 분 후 1/9를 포함 하는 agarose 코팅 접시 배아 전송 x MMR 및 25 ° c.에 품 어 또한 배아 이식 받는 사람 역할을 하 uninjected 형제의 접시를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
페 트리 접시 (60 m m) ~ 5 m m를 포함 하는 준비-0.3에서 1 %agarose 두꺼운 층 x MMR, X. tropicalis또는 1에서 이식 하 고 X. laevis에 대 한 x MMR.
	<ol>
<li>만들기 우울증 ~ 3-4 m m 3를 삽입 하 여 깊은-4 우물 형 (96-잘 PCR 플레이트 절단 하 여 만든) x 녹은 agarose 접시를 붓는 때에 ( 그림 1C 참조 및 D). 몰드는 agarose는 강화 된 때까지 링 스탠드에 부착 된 클램프를 사용 하 여 페 트리 접시의 바닥 위에 몇 밀리미터를 잡으십시오.</li>
		<li>또한, 우물 1/9에 1 %agarose 얇은 층으로 코팅 하 여 집 개별 배아 24-잘 접시에 게 x MMR. 참고: 이러한 우물에 추가 문화 매체는 MMR 보충 gentamycin 황산/mL의 50 µ g 1/9 x.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. PGCs의 이식
<ol><li>때 배아 그냥 무대에 도달 Nieuwkoop와 페이 버28 blastula 9 (그림 2A), ~4.5 h 후 수정 (hpf) X. tropicalis, 25 ° C 배양 기에서 그들을 제거 하 고 추가 대 한 실내 온도에 equilibrate 수 있도록 0.5 h입니다.</li>
	<li>5 이식 하려면 hpf (그림 2B)를 사용 하 여 파스퇴르 피 펫 (Cas9-sgRNA 주사) 한 PGC 기증자 배아 전송 0.3에서 (단계 1.7에서에서 만든) 불경기를 포함 하는 60 m m agarose 접시 x MMR (1 또는 x MMR X. laevis를 사용 하는 경우). 또한 한 uninjected 형제 태아,이 접시를 이식 받는 전송. 참고: 그것은 중요 이러한 배아의 각각의 정체성 혼동 하지는.</li>
	<li>수동으로 집게를 사용 하 여 각 배아에서 vitelline 봉투를 제거 하 고 그들의 식물성 극 보기에서 및 수술에 대 한 접근은 모두 배아를 회전. 참고: 배아의 수동 드 vitellination의 설명 이전 되었습니다 설명된26.</li>
	<li>눈 썹 머리 칼의 날카로운 팁을 사용 하 여, 4 개의 얕은 절 개는 blastopore를 표시 하는 미래의 병 셀 형성 됩니다 영역 내부 받는 사람 배아의 식물성 극에 사각형의 형태로 확인 합니다. 태아, 표면, 및 위쪽으로 머리 루프와 배아를 안정화 하는 동안 움직임을 슬라이스 하는 게 바로 아래에 눈 썹 머리 칼 끝을 삽입 하 여 절 개를 확인 합니다. 참고: 그림 2 4.5-7.0 hpf 셀 크기를 보여 병 세포 (점선된 흰색 원)을 형성할 것 이다 예측에 대 한 가이드를 제공 하 고에서 뉴캐슬과 간격 배아의 식물 경관을 보여준다. 목표 파선된 블랙 박스 표시 됩니다 incisions를 만드는 것입니다.</li>
	<li>사각형의 네 면 절 개에 의해 delineated는, 일단의 약 1/3 ~ 1/2 blastocoel 바닥에 거리의 깊이 도달 비슷한 절삭 동작을 사용 하 여 눈 썹 머리 칼으로 각 절을 심화.</li>
	<li>받는 사람 배아에서 식물 조직 explant 무료 (그림 3A 및 B) 수평 (식물 표면에 평행) 함으로써 깊은 식물 지역에서 cut(s). 참고: PGC 포함 된 식물성 explant의 크기는 약 0.4-0.45 m m 면 당 및 0.25-0.3 m m 깊이에서. 받는 사람 배아에서이 식물 explant 이상 필요 하 고 따라서 옆으로 폐기를 설정 해야.</li>
	<li>신속 하 게 작업,이 절차 (단계 2.4-2.6) 이식에 대 한 비슷한 크기 식물 조직 파편을 만드는 PGC 기증자 배아에 반복 합니다. 참고: 그것은 그것의 열려있는 상처를 치유 받는 사람 배아에 대 한 시간을 최소화 하기 위해 작은 지연으로이 두 번째 해 부를 실시 하는 것이 중요.</li>
	<li>일단 PGCs를 포함 하는 조직 기증자 태아에서 제거, 눈 썹 머리 나이프와 머리 루프를 사용 하 여이 explant 받는 사람 배아에서 만든 오프닝에 위치로 이동. 참고: 기증자 이식의 내부 표면 내부 받는 사람 배아의 직면 한다. 받는 사람 배아를 이식의 등 쪽 복 부와 왼쪽 오른쪽 축의 방향에 맞게 필요는 없습니다.</li>
	<li>눈 썹 머리 칼, 이식의 표면에 병렬 개최의의 긴 가장자리를 사용 하 여 부드럽게 눌러 받는 사람 배아의 식물 표면에 오프닝으로 이식.</li>
	<li>이식 배치 되었습니다 일단 부드럽게 슬라이드 "시체" 기증자 배아의 agarose 표면에 걸쳐 agarose 우울증으로 하는 hairloop 또는 눈 썹 머리 칼의 샤프트를 사용 합니다. 시체의 오픈 상처 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 하십시오. 그렇지 않다면, 눈 썹 머리 칼을 사용 하 여이 방향을 달성 하기 위해 배아를 회전.</li>
	<li>받는 사람 배아 이식 장소에는 인접 한 우울증으로 치유와 슬라이드 하 고 마찬가지로 이식할된 식물성 극 조직 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 한다.</li>
	<li>다른 이식/시체 쌍;을 만듭니다 기증자와 받는 사람 배아의 다른 쌍을 사용 하 여이 절차 (단계 2.1-2.11) 반복 이러한 빈 우울증을 전송 합니다. 참고: 중요 한 시체 및 배아 이식-베어링의 일치 쌍을 추적 하는 표기법은 이다. 기증자 시체 이식 베어링 동물 성적인 성숙을 도달할 때까지 쉽게 분석 될 수 없습니다 이식된 PGCs에 Cas9-sgRNA-유도 된 mutagenesis의 효율성에 대 한 프록시로 사용 됩니다 (아래의 단계 3.3, 참조 및 토론 ).</li>
	<li>계속 이식 배아 약 gastrula 조기에 10, 약 6.5는 도달할 때까지 X. tropicalis 에서 hpf ( 그림 2E참조).</li>
</ol>3. 후 배아 들 치유
참고: 이식 ~ 30 분 이내에 치료 하 고 정상 세포 세포의 용 해 (그림 3C) 배아에서 풍기에서 일부 yolky 파편을 관찰 하는.
<ol><li>
일단 치유, agarose 코팅 24-잘 접시의 개별 웰 스에 우울증에서 매우 부드럽게 전송 배아에 파스퇴르 피 펫을 사용 합니다. exudate 됩니다 (그림 3D) 전송 하는 동안 혼합 유체에 의해 제거.
	<ol>
<li>대량 해결책에 직면을 식물 극 배치 되도록 배아를 회전 합니다. 다시, 기증자 시체를 놓고 태아 쌍;의 유지에 도움을 받는 인접 한 우물에 이식 이 정보를 기록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>숙박 문화에 대 한 25 ° C 배양 기에 태아를 포함 하는 24-잘 접시를 전송 합니다. 참고: 다음 날, 배아는 도달 했다 tailbud 단계.</li>
	<li>Agarose 코팅 6 잘 플레이트 MMR 보충 gentamycin 황산/mL, 잘 당 1 태아의 50 µ g 1/9 x를 포함 시키려면 이식 받는 사람을 이동 합니다. 이러한 일치 하는 기증자 시체의 명확한 기록 유지 이식 받는 사람.</li>
	<li>시퀀싱 PCR amplicons5,,1724 또는 PCR amplicons ( 토론참조)에 의존 하는 다른 방법을 사용 하 여 의해 mutagenesis 효율성 평가, 0.2 mL PCR 스트립 튜브를 개별 시체를 이동 합니다. 매체의 대부분을 제거 하 고 100 µ L 세포의 용 해 버퍼24 K (PK)으로 위아래 pipetting P200 피 펫을 사용 하 여 반복 하는 성분을 포함 하에서 균질.</li>
	<li>배아 세포24 PK 소화를 허용 하도록 하룻밤 6 h 56 ° C에서 수행 합니다. 10 분 뒤에 4 ° c 빠른 냉각 90-95 ° C에가 열 하 여 PK를 비활성화 추가 정리 단계 없이 lysates를 사용 하 여 씨를 직접 생어 DNA 시퀀싱24에 대 한 짧은 amplicons PCR 반응. -20 ° c.에 lysates 저장 참고: 몇 일 이내는 tadpoles 먹이 단계 (약 단계 45-46)에 도달 한다 그리고 planktonic 분말 (세라 미크론)의 정지 먹 일 수 있습니다.</li>
	<li>청결을 유지 하 고 미생물 자라 난 최소화를 문화 매체의 매일 변화 ~ 1 주 후 물방울 흐름 순환 수 중 시스템에 tadpoles 작은 탱크를 이동 합니다. 시퀀싱 데이터를 사용 하 여 낮은 mutagenesis 효율 tadpoles에서 매우 효율적으로 mutagenized PGCs와 tadpoles를 분리. 변 태 완료 되 면 연구실에서 성인 수생 시스템에는 froglets를 이동 합니다. 참고: 국가 Xenopus 자원 (해양 생물학 연구소, 나무 구멍, MA)에 의해 개발 된 식이요법 올챙이 먹이29 그리고 성인 개구리 유지 보수30에 대 한 가이드를 제공 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 상관이 있다.

이 보고서에서는 PGCs. 이식의 PGCs를 포함 하는 식물 조직의 이식에 대 한 상세한 프로토콜을 수정 하는 생식을 게놈 편집 기술 (예: CRISPR/Cas9)와 함께에서 사용 하면서 동물의 거의 모든 그것의 체세포 조직 유전자 야생 유형으로 유지. 성공 하려면 leapfrogging 위해 수행 간이식을 수행 하기 전에 고려해 야 할 중요 한 요인의 수가 있다.
돌연변이 체 대립 유전자와는 생식의...

어떻게 유전자 표현 형 인코딩합니다 Mendel의 법률의 재발견 이후 생물학에서 주요 질문 되었습니다. 인코딩된 제품 약속 잠복 새로운 생물학 및 장황 질병 상태에 대 한 도구를 제공 하기의 기능과 유전자, 그들의 규칙 및 유전자 네트워크 내에서 상호 작용의 역할의 이해. 절반 이상이 세기1, 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 기초 생물학 및 의학, 발달의 유전 통제를 포함 하 여 다양 한 주제에 대 한 연구에 대 한 선도 모델을 하고있다. 역사적으로, Xenopus 에 대부분의 연구는 allotetraploid 개구리, X. laevis, 사용 하지만 더 최근에, 그것의 diploidy 인 X. tropicalis 개발 되었습니다 양서류 유전자 모델. 완전 한 게놈 시퀀스 두 Xenopus 종2,3에서 조립 되어 있다. "개구리 커뮤니티"입니다 지금 전환점에 어디 기본 게놈 수정 기술 허용 유전자 기능 연구 거의 것입니다. 프로그래밍 가능 CRISPR/Cas9 endonucleases 유전자의 mutagenesis를 biallelic 돌연변이 가능한 대부분의 세포에서 동물4,,56,7의 고효율 만들었습니다. 8,9,,1011. Bhattacharya 외 하 여 강조 하는 이러한 연구 12 및 Shigeta 외. 13, 많은 유전자의 기능 mutagenesis F0 모자이크 동물에 의해 공부 될 수 있다 나타났습니다. 이 접근에는 많은 이점이; 그러나, Cas9-sgRNA-microinjected 배아 종종 기능 (LOF)의 불완전 한 손실로 인해 가변 고기를 표시합니다. 더 크게, 돌연변이 라인의 세대는 매우 일부 응용 프로그램에 대 한 유리한-특히 모성 mRNA 기여 있는 유전자를 공부를 할 때. 모성 mRNAs 및 단백질, 그리고 epigenetics에 그들의 영향 embryogenesis14,,1516, 많은 유전자의 초기 발달 기여를 렌더링으로 오랜된 기간 동안 유지 F0 분석에의 내 화 따라서, 다른 LOF 방법이 제시해 주셔야 합니다.
돌연변이 체 라인을 만들 경우, 경로 homozygous LOF 배아를 얻는 몇 가지 장애물 있다. 첫째, 효율적인 mutagenesis biallelic 돌연변이 생산 하는 필수 유전자 기능의 손실이 가능한 라인의 생산을 방해 하는 성적 성숙에 살아남기 위해 실패에서 하기 때문에 불리 한 될 수 있습니다. 일반적인 솔루션은 Cas9-sgRNA 전달 금액의 주의 적정. 여기, 목표는 또한 생식 mutagenesis 효율성을 극대화 하면서 치 사 율 감소 사이의 균형을 달성 하는. 두 번째 문제 표준 사육 체계에서 발생 하는 phenotypic 분석 F2 세대까지 지연 됩니다. 표준 방식을 사용 하 여, 성적 돌연변이 체 대립 유전자는 생식을 통해 F1 heterozygous "캐리어", 성적 성숙 성장 다음 생산 outcrossed는 전송 하는 F0 동물 성숙. 2 F1 heterozygotes는 다음 25%의 예상된 Mendelian 주파수에서 F2 돌연변이 배아를 생산 하기 위해 intercrossed. 따라서, 번 식의 2 세대 돌연변이 고기의 분석을 위해 필요 하다. 돌연변이 동물 homozygotes 또는 복합 heterozygotes (즉, 자손 포함 하는 두 개의 다른 돌연변이 체 대립 유전자 F1 intercross에서 사용 하는 부모의 동물의 genotypes에 달려 있는) 수 있습니다.
프로그래밍 가능한 nuclease 중재 mutagenesis 세균 세포에 기초가 넘기17라는 새 메서드를 제한 하 여 이러한 장애물을 극복할 수 있습니다. 두 가지 주요 구성 요소는 leapfrogging: Cas mRNA sgRNA, 또는 nuclease sgRNA 단지 (또는, 원리, TALENs 또는 아연 손가락 nucleases)의 (1) microinjection 단일 셀 단계에서 효율적으로 배아 유전자 mutagenize를, 다음 (2) PGCs의 생 PGCs 제거 되었습니다 wildtype 형제 배아로 이식. 두 단계는 돌연변이 세균 세포로 효율적이 고 완전 한 생식 보충 때 얻어질 수 있다. Blackler 1960 년대 Xenopus PGCs 늦은 neurula에서 배아 초기 tailbud 단계18,19사이 이식 될 수 있는 시연. Leapfrogging, Blackler의 접근 PGCs 태아20,21의 식물성 극에 지역화는 blastula 단계17, 간이식을 수행 하 여 수정 되었습니다. Gastrulation 전에 이식 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 이식 및 후속 표준 개발의 engraftment 이식 blastula 단계 (관찰 되지 않은)에서 수행 하는 경우 더 효율적으로 발견 되었다. 둘째, zygotic 녹음 방송 시작 직후 blastula 단계 간이식을 수행, 하나 치 발달 유전자 변이 gastrulation 또는 그 방해를 그렇지 않으면 잘못 된 늦은 neurulae 이어질에서 발생을 피할 수 있다. PGC 이식-베어링 ("사간") 배아는 성적 성숙, 성장 및 이러한 F0 동물 사이 intercrosses는, 많은 경우에, F1 자손의 100% (대부분 되 고 복합 LOF 형 표시 증명 heterozygotes), 대상된 돌연변이와 완전 한 생식 교체를 나타내는.
그것 leapfrogging Xenopus에 유전 접근을 가속화 될 것으로 예상 된다. 또한 임산부 효력 유전자 (게시 되지 않은 관찰) LOF 분석에 대 한 "호스트 전송" 방법22 에 대 한 대안을 제공 leapfrogging. 현재 발행물에서 PGC 이식에 초점 특히 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 됩니다 X. tropicalis 에서 ( X. laevis에 대 한 작은 수정). Xenopus작업 다른 실험실에 더 빠른이 기술 이전을 촉진 하기 위하여 여기 PGCs의 식은 설명 했다. 이 방법의 원리 (예: urodeles), 다른 양서류에 성공 해야 하 고 방법론에서 유기 체 관련 수정 효율적인 mutagenesis 달성 될 수 있는 다른 많은 동물을 응용 프로그램에 대 한 허용 해야 하 고 PGCs는 쉽게 transplantable.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

편집 하는 게놈 돌연변이 라인의 창조 많은 유기 체에서 유전자 분석을 가속. CRISPR/Cas9 메서드가 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 생물 의학 연구에 대 한 오랜 모델 유기 체에서에서 사용 하기 위해 적응 되었습니다. CRISPR/Cas9-타겟 mutagenesis와 homozygous 돌연변이 라인을 만들기 위한 전통적인 번 식 계획 몇 가지 어렵고 힘 드는 단계 있다. 특히 노크 embryogenesis에 필수적인 유전자와 관련 된 장애를 극복 하기 위해 돌연변이 배아의 생성을 촉진 하기 위하여 leapfrogging 이라는 새로운 방법을 개발 되었다. 이 기술을 활용 하 여 "잘라내기 및 붙여넣기" Xenopus 배아의 견고성 embryological 방법. Leapfrogging PGC 연기나 wildtype 형제에 효율적으로 mutagenized 기증자 배아에서 원시 생식 세포 (PGCs)의 전송을 사용합니다. 이 메서드는 공상 동물 wildtype 체세포 돌연변이 생식을가지고 작성 하 여 필수적인 유전자의 효율적인 돌연변이 대 한 수 있습니다. 때 두 F0 동물 운반 "도약 이식" (즉, 돌연변이 세균 세포)는 intercrossed, 그들은 생산 homozygous, 또는 복합 heterozygous, null F1 배아, phenotypic 데이터를 얻기 위해 전체 생성 시간 절약. F0 phenotypic 분석 CRISPR/Cas9 mutagenesis 다음 내 화물은 임산부 효력 유전자 분석을 위한 새로운 접근 방법을 제공 합니다 또한 leapfrogging. 이 원고 leapfrogging PGC 이식 성공적으로 수행 하는 방법에 대 한 특별 한 강조와 함께 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

이식, 다음 CRISPR/Cas9 mutagenesis의 효능의 질적 결정 축산 성장과 성적 성숙 동물 유지에 노력을 소비 하기 전에 수행 되어야 합니다. 때문에 들고 토끼 뜀 이식 동물 somatically wildtype는 생식은 직접 측정을 위한 접근 하기 어려운, 기증자 태아의 시체를 저장 중요 해 집니다. 시체에서 DNA 분석 이식된 생식17에서 발생 하는 mutagenesis의 범위에 대 한 프록시 역할...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K 조회수.  University of California, Irvine. 생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

연구

발생학

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

유전학

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

생물학

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

요약

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줄기 세포처럼

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