우리는 유효하게 그들을 둘러싸고 있는 지방의 존재 또는 부재에 있는 동일 동물 또는 다른 동물 또는 동맥에서 또는 내피의 존재 또는 부재에서 준비를 유효하게 비교할 수 있도록 아주 엄격한 프로토콜이 필요합니다. 이 실험 기술의 주요 장점은 우리가 동상 측정 조건하에서 동일한 동맥의 고리를 비교하고 따라서 우리가 조사하는 실험 요인의 영향에 관하여 유효하게 결론을 내릴 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 다른 유전자 변형 동물의 지방 조직에 의해 혈관 반응성의 변조에 대한 통찰력을 제공합니다.
지방 조직 기능 장애는 고혈압과 관련 심장 혈관 합병증에 대한 독립적 인 위험 요소를 나타냅니다. 당사의 근사 에는 특히 장착 중에 선박이 손상되지 않도록 하고 선박이 다양한 자극에 적절하게 반응하도록 하기 위해 각 지점에서 각 지점에서 극도의 주의가 필요한 여러 가지 복잡한 단계가 포함됩니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 막심 동맥 고리의 준비 및 해부로 이 절차를 시작합니다.
컴퓨터를 켜고 데이터 기록 소프트웨어를 엽니다. 실험을 새 이름으로 랩 차트 데이터 파일로 저장하여 원래 설정 파일을 덮어쓰지 않도록 합니다. 정규화 설정 창을 열고 K 팩터를 하나로 설정합니다.
IP 교정, 대상 압력, 온라인 평균 시간 및 지연 시간의 기본 값을 수락합니다. 설정을 저장하려면 확인을 클릭합니다. 관심 있는 채널을 선택하고 정규화 창에서 와이어 직경, 조직 끝점 및 초기 마이크로미터 판독을 입력합니다.
정상화 절차를 시작하려면 마이크로미터 나사를 시계 반대 방향으로 돌려 혈관에 첫 번째 수동 스트레칭을 적용합니다. 선박이 안정화될 때까지 3분을 기다린 후, 정규화 창에 새 마이크로미터 판독값을 입력합니다. 벽 장력은 자동으로 계산되고 그래프의 점으로 표시됩니다.
각 수동 스트레칭 후, 제어 크렙스 버퍼를 150 밀리알륨 염화칼륨을 함유한 이소 삼투압 높은 칼륨 크렙으로 대체하십시오. 수축이 약 3분 만에 고원에 도달하면, 칼륨 활성화 력으로부터 각 스트레치에서 패시브 포스를 빼서 활성력을 기록한다. 벽 장력과 내부 둘레 값을 계산합니다.
높은 칼륨 버퍼를 신선한 크렙스 버퍼로 대체하여 높은 칼륨 상태를 제거하십시오. 5분 동안 세 번 세탁을 반복합니다. 수동 스트레칭을 유도하고 활성 장력이 감소하기 시작할 때까지 대체 회전에서 활성 수축을 유도하여 정규화 단계를 반복합니다.
높은 칼륨 크렙스 버퍼를 철저히 씻어 내고 30~45분 동안 준비를 균형하게 준비합니다. 후속 실험 중에 활성 수축 응답만 기록되도록 기저 장력을 0으로 재설정합니다. 각 동맥의 인접한 섹션에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 페어링된 동맥 링을 준비하고 마운트합니다.
PVAT가 그대로 있는 동맥 링 1개를 준비하고 다른 하나는 PVAT를 제거합니다. 정상화 후, 크렙스를 함유한 챔버에 115밀리알륨 염화칼륨 용액을 추가하여 높은 칼륨 크렙스 버퍼로 동맥 세그먼트를 사전 계약한다. 고원 기간에 수축 후, 높은 칼륨을 씻어 신선한 aerated 크렙스 버퍼로 버퍼를 교체.
5분 동안 세 번 세탁을 반복합니다. 염화칼륨 자극을 반복하고 세 번 세척하고 염화칼륨 자극으로 인한 장력에서 기준장력을 빼서 염화칼륨에 대한 최대 수축 반응을 기록한다. 마지막 수축 및 세척 후, 따뜻하고, 분화 된 크렙스 버퍼로 챔버를 리필하고 다음 작업을 수행하기 전에 약 30 분 동안 동맥을 복구 할 수 있습니다.
각 챔버에, 유족의 누적량을 추가하여 정지 제제의 농도 의존성 증가 및 등소장력을 유도한다. 고뇌의 마지막 복용량을 추가 한 후, 철저하게 약물을 씻어 신선한 크렙스 버퍼로 챔버를 다시 작성합니다. 염화칼륨의 백분율이 증가함에 따라 농도 의존성 반응을 플롯하여 최대 수축을 유도합니다.
산화 질소의 기여를 평가하기 위해, phenylephrine의 첨가 전에 30 분 동안 산화 질소 신디마제 억제제 L-NAME로 제제를 배양. 제2 농도 응답 곡선을 순차적으로 수행하기 위해, 챔버를 완전히 반복적으로 세척하여 톤의 추가 변화가 관찰되지 때까지 이전의 모든 작용제를 제거하십시오. 길이 장력 관계의 정규화는 표준 차우 또는 고지방 식단으로 공급되는 마우스 모델으로부터 분리된 막질 동맥에 대해 수행되었다.
수은 교원 압력 또는 IC100의 100밀리미터에 해당하는 내부 둘레가 얻을 때까지 동맥 세그먼트의 증분 스트레칭에 의해 수동 길이 장력 관계가 확립되었다. 각 스트레칭 후, 115 밀리머발륨 염화 칼륨수축을 자극하기 위해 적용되었다. 활성 길이 장력 곡선은 Y축의 활성 힘 데이터와 X축의 마이크로미터 데이터에서 계산된 IC 값에서 플롯되었습니다.
피크 고원 내에 있는 IC 값은 IC1입니다. 정규화 계수인 K는 IC1 및 IC100의 비율로 계산되었으며, 이는 후속 실험에서 동일한 용기 유형의 샘플에 적용될 수 있었다. 여기에 는 주변 PVAT의 유무에 관계없이 막질 동맥에서 페닐레프린에 대한 혈관 수축 반응의 출력 기록이 표시됩니다.
페닐레프린의 누적 농도는 16주 된 아디포셋 1마리마우스로부터 수집된 막질 동맥의 수축을 자극하기 위해 적용되었다. 수축 반응은 150 밀리알륨 염화칼륨의 백분율로 기록되고 최대 수축을 유도했다. 수축 곡선 아래 영역은 비교를 위해 플롯되었습니다.
adiposet 1 마우스에서 PVAT페닐프린에 대한 반응에 대한 수축 방지 효과를 유도. KCL 유도 수축을 얻을 때, 응답은 안정적이고 안정적이어야 한다. KCL의 3가지 증분 투여 후에도 응답이 계속 증가하는 경우 KCL 자극이 필요할 수 있습니다.
긴장의 최적 조건을 달성하기 위해, 정상화 단계는 매우 중요하다, 이 혈관을 열 수있는 힘을 결정으로. 제대로 수행되지 않으면 전체 실험에 영향을 미칩니다. 이 프로토콜은 페닐레프린 유도 수축 또는 이완 이외에 다른 설정에 적용될 수 있다.
예를 들어, 심분 지방 조직의 존재 또는 부재에서, 자율 신경, 또는 내피. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 비만, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 병리학 적 조건하에서 병들게 된 동물 모델의 작은 혈관을 검사 할 수 있습니다.
