RNA 결합 단백질은 세포 생리학에 필수적입니다. 중요한 것은, RBP는 정자 발생을 통해 높게 표현되고 세균 세포의 모든 단계 도중 필수적인 전사 후 레귤레이터로 잘 문서화되었습니다. 바인딩 대상의 식별은 RBP의 기계주의 적 역할을 해명하는 데 중요합니다.
이 프로토콜은 내인성 직접 RNA 표적을 포착하고 포유류 고환에서 eCLIP에 대한 적용 가능한 기초를 확립하기 위한 eCLIP 방법의 적응된 적용을 나타낸다. 이 방법의 주요 장점은 비방사성, 적은 시간 집약적이며, 크기 일치 입력이 본격적인 대상에 적합한 배경역할을 하기 때문에 더 강한 신호 대 잡음 비율을 제공한다는 것입니다. 마지막으로, 우리는 서브클론의 소규모 시퀀싱이 깊은 시퀀싱을 따르는 데 유용하다고 생각합니다.
절차를 시연하는 것은 내 동료 인 쉬 치우시 (Xu Qiushi)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 각 면역 강수량 실험에 적합한 연령의 쥐로부터 약 100 밀리그램의 고환을 수확하십시오. 얼음 차가운 PBS에 조직을 배치합니다.
미세 한 기울어진 핀셋을 사용하여 튜니카 알부진을 부드럽게 제거합니다. 3 밀리리터의 얼음-차가운 PBS를 조직 분쇄기에 추가하고 느슨한 유리 유봉을 사용하여 가벼운 기계적 힘으로 조직을 세트리알트합니다. 다음으로, 조직 현탁액을 세포 배양 접시에 옮기고, 최대 6밀리리터까지 얼음차가운 PBS를 추가한다.
접시를 빠르게 흔들어 액체가 접시 바닥을 고르게 덮습니다. 254 나노미터에서 제곱 된 센티미터 당 400 밀리 줄로 얼음에 서스펜션을 세 번 크로스 링크. 각 조사 사이에 서스펜션을 혼합해야 합니다.
이어서, 15밀리리터 원모형 튜브에서 서스펜션을 수집하고, 원심분리기는 1, 200배, 5분간 4도에서 수집한다. 상체를 제거하고 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 그 후 서스펜션을 1.5밀리리터 원심분리튜브로 옮기는다.
원심분리기는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 폐기하고, 상주분리기를 폐기한다. 첫째, 125 마이크로리터의 단백질 A 마그네틱 비드를 시료당 신선한 원심분리기 튜브에 넣습니다. 구슬을 용액에서 분리하기 위해 자석에 튜브를 놓습니다.
10초 후, 상체를 제거하고 얼음 차가운 용해 버퍼 1밀리리터로 구슬을 두 번 씻으시다. 10 마이크로그램의 eCLIP 항체를 가진 차가운 리시스 완충제의 100 마이크로리터에서 구슬을 재차질한다. 실내 온도에서 45분 동안 튜브를 회전시합니다.
그런 다음 얼음 차가운 용해 버퍼 1 밀리리터로 구슬을 두 번 씻으신다. 시작하려면, 50x EDTA 가없는 단백질 억제제 칵테일의 22 마이크로 리터와 RNase 억제제의 11 마이크로 리터를 포함하는 차가운 용해 완충제의 1 밀리리터에 조직 펠릿을 다시 중단합니다. 15 분 동안 얼음에 샘플을 lysing 유지합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플을 초음파 처리합니다. 다음으로 각 튜브에 4개의 마이크로리터를 추가하고 잘 섞습니다. 1, 200 rpm에서 흔들면서 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
그 후, 희석 된 RNase의 10 마이크로 리터를 추가하고 잘 혼합. 섭씨 37도에서 5분간 배양하면서 1, 200 rpm에서 흔들리면 됩니다. 그런 다음 15, 000 배 g및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심분리기를 제거하여 lysate를 지웁습니다.
상체를 신중하게 수집하고 RWB 및 RRI 샘플에 대한 입력 샘플을 저장합니다. 먼저, 준비된 구슬에 용액 1밀리리터를 넣고 샘플을 섭씨 4도에서 2시간 또는 하룻밤 동안 회전시합니다. 그 후, 자기 스탠드와 구슬을 수집하고, 상체를 폐기.
900 마이크로리터의 고염 완충제로 구슬을 두 번 씻은 다음 900 마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 두 번 씻습니다. 그런 다음 1x 탈포릴화 버퍼의 500 마이크로리터로 구슬을 한 번 씻으시다. 먼저, 상체를 버리고 미세 파이펫 팁을 사용하여 잔류 액체를 제거하십시오.
각 샘플에 3프라임 리기션 마스터 믹스 25마이크로리터를 추가하고 조심스럽게 파이펫을 섞어 주세요. RNA 어댑터 X1A2.5 마이크로리터와 RNA 어댑터 X1B 2.5 마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 파이펫팅이나 플리킹으로 조심스럽게 섞으세요.
75분 동안 섭씨 25도에서 배양하여 튜브를 10분간격으로 섞어보도록 합니다. 차가운 세척 버퍼 500 마이크로 리터로 구슬을 한 번 씻으시다. 다음으로, 차가운 고염 버퍼 500 마이크로리터로 구슬을 한 번 씻은 다음 500 마이크로리터의 냉세척 버퍼로 세척합니다.
이 두 가지 세체를 다시 한 번 반복합니다. 구슬을 자기로 분리하고 미세 파이펫 팁을 사용하여 잔류 액체를 제거합니다. 100 마이크로리터의 냉세척 버퍼로 구슬을 재차 질주하고 20마이크로리터를 RWB 샘플로 새로운 튜브로 이동합니다.
4x LDS 샘플 버퍼 7.5 마이크로리터와 10배 샘플 감소제 3개에 추가하여 나머지 시료에 추가합니다. 1, 200 rpm에서 흔들면서 10 분 동안 섭씨 70도에서 배양하십시오. 그 후, 1 분 동안 얼음에 샘플을 냉각하고 원심 분리기는 1, 000 배 g와 1 분 동안 섭씨 4도에서 냉각합니다.
RWB 젤의 경우, 자석에 튜브를 놓고 비드에서 단백질을 분리합니다. 15 마이크로리터의 샘플을 각 우물에 적재합니다. 다음으로, 1x SDS 실행 버퍼의 500 밀리리터에 항산화제 500 마이크로리터를 추가합니다.
젤을 200볼트, 1x SDS 러닝 버퍼로 50분 간 또는 염료 전면이 바닥에 다질 때까지 실행합니다. 10%의 메탄올을 사용하여 1x 전달 버퍼에서 70분 동안 10볼트에서 니트로셀룰로오스 막으로 단백질-RNA 복합체를 전달한다. 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 5 %의 우유로 RWB 멤브레인을 차단하십시오.
TBST에서 막을 헹구고, TBST에서 1 차적인 항체로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오. 그 후 TBST로 두 번 씻고, 각 세척은 5분간 지속됩니다. 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 이차 항체와 함께 배양하십시오.
그런 다음 TBST로 멤브레인을 세 번 씻으시면 됩니다. 다음으로, ECL 버퍼 A의 동일한 볼륨을 혼합하고 버퍼 B.멤브레인에이 혼합물을 추가하고 1 분 동안 배양합니다. 멤브레인을 플라스틱 랩으로 덮고 필름을 개발하기 전에 실온에서 2 ~3 분 동안 X 선 필름에 노출하십시오.
이 연구에서는, RNase를 가진 성인 야생형 마우스의 고환에서 MOV10 eCLIP는 교차형 용재를 치료하고, 표적 단백질은 약 114킬로달톤인 성공적으로 농축된다. 다양한 샘플에서 1-10까지 희석된 cDNA의 qPCR 결과는 비교차식 샘플이 RNA 회수감소를 나타낸다는 것을 보여준다. 비교차 형 그룹의 Ct 값은 일반적으로 UV 크로스 링크 그룹보다 5 배 더 많은 것으로 관찰된다.
아가로즈 겔 전기포진을 통한 PCR 증폭 및 크기 선택에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있다. 프라이머 이머 제품은 약 140개의 기본 쌍에 나타납니다. 두 개의 대표적인 서브클론 서열의 UCSC 게놈 브라우저 보기는 MOV10 바운드 eCLIP 태그가 유전자 Fto의 3-PRIME UTR 내에 있는 것으로 밝혀졌다는 것을 보여줍니다.
3프라임 UTR 표적의 대략적인 비율은 75%를 차지하며 HEK293 세포 및 고환에서 의 MOV10 표적의 대부분과 일치합니다. 대조적으로, MOV10L1 바운드 eCLIP 태그는 piRNA 클러스터 내에 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MOV10L1이 piRNA 전구체를 대상으로 한다는 것을 나타낸다. piRNA 전구체 표적의 대략적인 비율은 이전 연구 결과에서 추세를 반영하는 42%를 차지합니다.
MOV10L1 eCLIP은 밀리리터당 40단위 RNase I 소화로 20개 미만의 베이스 쌍으로 비교적 더 많은 시퀀스를 생성합니다. 여기서 설명된 이 프로토콜은 RNA-RBP 상호작용 지식이 다소 부족한 재생에 eCLIP 방법의 고용을 나타낸다.
