Drosophila 멜라노가스터는 인체 건강과 자연 환경에 심각한 문제를 나타내는 내분비 파괴자와 같은 화학 물질의 잠재적 독성 및 내분비 효과를 생체 내에서 평가하는 강력한 모델입니다. EDC가 비행의 호르몬 수명 특성에 미치는 영향을 해결하는 데, 예를 들어, 이러한 변종, 다산, 발달 시간 및 수명. 그것은 생체 내 분비 장애를 조사하는 쉽고 저렴하며 빠른 방법입니다.
Drosophila에 있는 다산, 발달 및 수명은 이 프로토콜의 성공적인 결과를 지키기 위하여 주의 깊게 통제되어야 하는 몇몇 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 파리 를 사육하고 처리하는 데 최대한의 주의가 필요합니다. 선택된 EDC의 맛을 분석하기 위해, 마취 후, 플라이 베드에서 식품 착색과 혼합된 옥수수밀 배지를 함유한 4개의 평행 바이알로 15마리의 어린 파리를 이송한다.
대조군 바이알은 용매만을 포함하고, 다른 3개의 바이알은 선택된 EDC의 다른 용량으로 보충된다. 바이알을 가습된 인큐베이터에 1일 동안 천연 12시간 의 빛으로 보관하십시오. 파리를 다시 마취한 후, 고정된 파리를 백서로 옮기고 스테레오 현미경아래에 배치하여 관찰합니다.
대조군에 대하여 각 처리군의 복부 착색을 비교합니다. 파리의 생식 성능을 분석하려면, 부모 바이알로 각 EDC에 대한 파리의 세 바이알을 준비, 8 여성과 4 개의 남성에 10 옥수수 가루 매체의 밀리리터EE2로 보충. 제어를 위해, 파리 의 여섯 바이알을 준비, 각각 8 여성과 4 개의 수컷에 옥수수 밀 중간 식품의 10 EE2 용매로 보충.
후면은 섭씨 25도에서 인큐베이터로 날아갑니다. 그들의 발달 도중, 애벌레를 과밀하지 마십시오. 4 일 후, 부모를 제거하고 5 일 더 인큐베이터에 바이알을 반환에 에테르화를 통해 각 유리병을 반전.
9일 늦은 오후에 각 유리병을 이더라이저 위에 뒤집어 새로 나타난 모든 파리를 바이알에서 제거하고 하룻밤 사이에 18도의 다른 인큐베이터에 바이알을 넣습니다. 10일 오전, 드로소필라 이산화탄소 작업장에 있는 이질처리된 파리가 중간크기로 떨어지는 것을 막기 위해 배양 유리병을 조심스럽게 반전시키고, 면 스토퍼와 바이알 벽 사이의 유리병에 바늘이 달린 고무 튜브를 삽입한다. 밸브를 열어 이산화탄소를 전달합니다.
몇 초 안에, 현미경 아래 비행 침대로 파리를 전송합니다. 처녀 여성과 젊은 남성을 플라이 베드의 두 그룹으로 따로 모으게 하십시오. 작은 하위 그룹에서 파리의 각 그룹을 무작위로 세분화하고, 바이알 당 10 명의 여성 또는 20 명의 남성이 신선한 해당 옥수수 밀 매체로 채워져 있습니다.
인큐베이션을 계속하고 각 EDC에 대해 30 명의 처녀 여성과 30 명의 남성을 수집하고 90 처녀 여성과 90 명의 남성을 통제하십시오. 이 파리들은 4일 후 로클로션 이 될 때까지 섭씨 25도에 보관할 수 있습니다. 그런 다음 2일마다 신선한 해당 매체가 포함된 새 바이알로 전송합니다.
여성의 바이알에 애벌레가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 다음 치료를 위해 다른 순차 번호로 바이알을 라벨로 지정합니다. 마취 후, EE2 없이 신선한 옥수수 밀 토마토 매체를 포함하는 작은 유리병에 하나의 EE2 용매 처리 된 여성을 전송하고 전체에 걸쳐 제어를위한 하나의 EE2 용매 처리 남성을 추가합니다.
EE2 용매 처리 된 여성 또는 EE2 처리 된 여성과 각 처리에 대해 EE2 용매 처리 된 남성과 EE2 처리 된 남성과 EE2 처리 된 남성과 쌍. 25도에서 20 개의 단일 십자가를 집. 각 짝짓기 쌍을 EDC 없이 매일 10일 동안 신선한 옥수수밀 토마토 미디엄 바이알로 옮기습니다.
각 유리병을 매일 검사하여 달걀을 검사하고 불임 스프레드시트에 해당 수치를 보고합니다. 각 병병에서 새로 나타난 파리를 면밀히 확인하고 10 일 동안 성인 자손의 일일 수를 기록하십시오. 초기 짝짓기로부터 10일 후에 는 마지막 바이알 시리즈에서 부모를 제거합니다.
백과 분석 프로토콜에서, 첫째, 각 처리 단에 대 한, 설정 10 젊은의 유리병을 설정, 건강 한 파리 는 2 일 미만, 각각 6 여성과 3 개의 남성 에 10 EDC 없이 옥수수 밀 음식의 밀리 리터에 남성. 24 시간 동안 음식에 파리를 후면하고 짝짓기를 허용합니다. 그런 다음 처리 군당 10개의 병렬 바이알을 다른 EDC 농도로 보충한 신선한 옥수수밀 식품 또는 EE2 용매만으로도 대조군을 위해 준비한다.
메이트 된 파리를 이 새로운 바이알로 옮기. 다른 시리즈를 기록하기 위해 개발 스프레드시트를 만듭니다. 파리가 16시간 동안 알을 낳도록 허용하십시오.
그런 다음 바이알에서 부모를 제거합니다. 3~4일 동안 25도의 바이알을 배양하거나, 방황하는 애벌레가 보일 때까지 배양합니다. 매일, 같은 강아지를 두 번 계산하지 않도록 유리병의 외부에 각 강아지에 의해 순서대로 숫자를 작성하여 각 유리병에 새로운 강아지의 수를 계산합니다.
새로 등장한 강아지의 수를 3~4일 동안 신고하거나 더 이상 새끼 모양이 없을 때까지 보고한다. 9일부터 는 더 이상 성인이 나오지 않는 신흥 성인의 수를 매일 계산합니다. 개발 스프레드시트에 보고하고 원고에 따라 나머지 백과 분석 작업을 수행합니다.
수명 프로토콜에서, 먼저 8 명의 여성과 4 명의 수컷으로 20 개의 바이알을 설치하고 각각 10 밀리리터의 옥수수 밀 로 가득 채우고 섭씨 25도에 보관하십시오. 4 일 후, 파리를 버리고 바이알을 인큐베이터에 다시 놓습니다. 9일 늦은 오후에 새로 나타난 파리를 바이알에서 제거하고 바이알을 인큐베이터로 되돌려 보입니다.
16~24시간 후, 두 남녀 의 1일 된 성인 파리 250마리를 가벼운 이산화탄소 마취하에 4개의 그룹으로 나누고 성인 중형 식품을 함유한 250밀리리터 병으로 옮기고, 3개는 다른 EDC 농도로 보충되고, EE2 용매를 단독으로 사용하여 1마리를 섭취한다. 2~3일 동안 25도의 비행도유지하여 짝짓기를 할 수 있도록 하십시오. 그런 다음, 두 그룹으로 섹스로 파리의 각 집단을 정렬합니다.
각 치료 조건 내에서, 남녀 모두에 대 한, 무작위로 바이알 당 20 개인의 밀도에 5 개의 병렬 바이알으로 각 그룹을 세분화. 죽은 파리의 수가 이전 전송에서 살아남은 파리 의 수에서 빼는 수명 스프레드시트를 준비하여 각 전송의 생존자 수를 자동으로 얻습니다. 3 일 후, 동시에 해당 음식을 포함하는 새로운 바이알에 마취없이 파리를 전송하고 죽음을 확인합니다.
파리의 나이와 죽은 파리의 수를 기록합니다. 모든 파리가 죽을 때까지 3 일마다 전송을 반복합니다. 이 실험에서 수명 곡선은 각 EDC 농도 및 제어에 대해 경과된 일과 비교하여 누적 된 생존으로 플롯되었습니다.
제어를 위해, 생존 곡선이 상대적으로 높은 유지긴 긴 초기 기간 후, 그것은 약 60 일 후 기하 급수적으로 감소했다. EDC 노출 후 처리된 파리의 생존 곡선이 크게 영향을 받았으며 36일 후에 극적인 감소를 보였습니다. 분석 중인 병렬 바이알이 매우 유사해야 하며, 그렇지 않으면 어떤 것을 버릴지 이해하기 어려울 것입니다.
따라서, 우리는 큰 샘플 크기를 사용하여 좋은 실험 연습을 채택, 세심한주의를 기울이는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 따라, 또한 선택된 내분비 중단기의 트랜스제너레이션 영향을 평가하고 다른 내분비 파괴자의 조합의 잠재적 인 첨가제 효과를 테스트할 수도 있다.
