Drosophila melanogaster est un modèle puissant pour évaluer in vivo les effets toxiques et endocriniens potentiels des produits chimiques, tels que les perturbateurs endocriniens, qui représentent un grave problème pour la santé humaine et les environnements naturels. S’attaquer à l’effet des CED sur les traits de vie hormonaux de la mouche, tels que la fécondité, la fertilité, le temps de développement et la durée de vie. C’est un moyen facile, bon marché et rapide d’enquêter sur les perturbations endocriniennes in vivo.
La fertilité, le développement et la durée de vie dans Drosophila peuvent être affectés par plusieurs facteurs qui doivent être soigneusement contrôlés pour assurer le succès de ce protocole. Par conséquent, une attention maximale dans l’élevage et la manipulation des mouches est nécessaire. Pour goûter au goût de l’EDC sélectionnée, après anesthésie, transférez 15 jeunes mouches du lit de mouche à quatre flacons parallèles contenant du milieu de semoule de maïs mélangé à une coloration alimentaire.
Le flacon de commande contient le solvant seul, et les trois autres flacons sont complétés par différentes doses des CED sélectionnés. Gardez les flacons dans un incubateur humidifié pendant une journée avec une lumière naturelle de 12 heures. Après anesthésier à nouveau les mouches, transférez les mouches immobilisées sur un livre blanc et placez-les sous un microscope stéréo pour l’observer.
Comparez la coloration abdominale de chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin. Pour améliorer la performance reproductive des mouches, préparez trois flacons de mouches pour chaque EDC en tant que flacons parentaux, avec huit femelles et quatre mâles dans 10 millilitres de milieu de semoule de maïs complétés par eE2. Pour la lutte, préparer six flacons de mouches, chacun avec huit femelles et quatre mâles dans 10 millilitres de farine de maïs moyen alimentaire complété par solvant EE2.
L’arrière vole dans un incubateur à 25 degrés Celsius. Pendant leur développement, évitez de surcharger les larves. Après quatre jours, inverser chaque flacon sur un étherisateur pour enlever les parents et retourner les flacons à l’incubateur pendant cinq jours de plus.
En fin d’après-midi du neuvième jour, inverser chaque flacon au-dessus d’un étherisateur pour enlever toutes les mouches nouvellement émergées des flacons et mettre les flacons dans un autre incubateur à 18 degrés Celsius pendant la nuit. Le matin du jour 10, sur un poste de travail sur le dioxyde de carbone de Drosophila, inversez soigneusement le flacon de culture pour empêcher les mouches anesthésiées de tomber sur le milieu et insérez un tube en caoutchouc avec une aiguille dans le flacon entre le bouchon de coton et le mur de flacon. Ouvrez la vanne pour fournir du dioxyde de carbone.
En quelques secondes, transférez les mouches dans un lit volant au microscope. Recueillir les femelles vierges et les jeunes mâles séparément en deux groupes sur le lit de mouche. Subdiviser aléatoirement chaque groupe de mouches en petits sous-groupes, avec 10 femelles ou 20 mâles par flacon rempli de farine de maïs fraîche correspondante moyenne.
Poursuivre l’incubation et recueillir 30 femelles vierges et 30 mâles pour chaque EDC, et 90 femelles vierges et 90 mâles pour le contrôle. Abritez ces groupes de mouches à 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient âgées de quatre jours après l’éclosion. Ensuite, transférez-les dans de nouveaux flacons contenant du milieu correspondant frais tous les deux jours.
Vérifiez qu’il n’y a pas de larves dans les flacons des femelles. Étiquetez ensuite les flacons avec une série différente de nombres séquentiels pour le traitement suivant. Après l’anesthésie, transférer une femelle traitée au solvant EE2 dans un petit flacon contenant du milieu frais de tomate semoule de maïs sans EE2 et ajouter un mâle traité au solvant EE2 pour le contrôle à travers.
Jumeler un mâle traité à l’EE2 avec une femelle traitée au solvant EE2 ou une femelle traitée à l’EE2 avec un mâle traité au solvant EE2 pour chaque traitement. Maison 20 croix simples à 25 degrés Celsius. Transférer chaque paire d’accouplement dans des flacons moyens de tomates semoule de maïs fraîches sans EDC tous les jours pendant les 10 jours suivants.
Inspectez visuellement chaque flacon chaque jour pour les oeufs et signalez leur nombre sur la feuille de calcul de fertilité. Dans chaque flacon, vérifiez de près les mouches nouvellement émergées et enregistrez le nombre quotidien de descendances adultes au cours de la période de 10 jours. Après 10 jours à partir de l’accouplement initial, retirez les parents de la dernière série de flacons.
Dans les protocoles d’analyse de l’éclosion, d’abord, pour chaque groupe de traitement, mettre en place 10 flacons de jeunes mouches en bonne santé de moins de deux jours, chacune avec six femelles et trois mâles dans 10 millilitres d’aliments de semoule de maïs sans EDC. Élever les mouches sur la nourriture pendant 24 heures et leur permettre de s’accoupler. Préparez ensuite 10 flacons parallèles par groupe de traitement avec 10 millilitres chacun d’aliments frais de semoule de maïs complétés par différentes concentrations d’EDC ou le solvant EE2 seul pour le contrôle.
Transférez les mouches agenées sur ces nouveaux flacons. Faites une feuille de calcul de développement pour enregistrer les différentes séries. Laisser pondre les mouches pendant 16 heures.
Ensuite, retirez les parents des flacons. Incuber les flacons à 25 degrés Celsius pendant trois à quatre jours, ou jusqu’à ce que les larves errantes soient visibles. Chaque jour, comptez le nombre de nouvelles nymphes dans chaque flacon en écrivant un numéro dans l’ordre par chaque pupe à l’extérieur du flacon pour éviter de compter deux fois la même pupe.
Signalez le nombre de pupes nouvellement apparues pendant trois à quatre jours, ou jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de pupes. À partir du neuvième jour, compter le nombre d’adultes émergents par jour, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’adultes. Signalez-le sur la feuille de calcul du développement et effectuez le reste de l’analyse d’éclosion selon le manuscrit.
Dans le protocole de durée de vie, d’abord mis en place 20 flacons avec huit femelles et quatre mâles, chacun rempli de 10 millilitres de nourriture semoule de maïs et les loger à 25 degrés Celsius. Après quatre jours, jeter les mouches et remettre les flacons dans l’incubateur. En fin d’après-midi du neuvième jour, retirez toutes les mouches nouvellement émergées des flacons et retournez les flacons à l’incubateur.
Après 16 à 24 heures, divisez 250 mouches adultes d’un jour des deux sexes en quatre groupes sous anesthésie légère de dioxyde de carbone et transférez-les dans des bouteilles de 250 millilitres contenant des aliments moyens pour adultes, trois complétées par différentes concentrations d’EDC et une avec le solvant EE2 seul. Maintenez les mouches à 25 degrés Celsius pendant deux à trois jours pour leur permettre de s’accoupler. Ensuite, trier chaque cohorte de mouches par sexe en deux groupes.
Dans chaque condition de traitement, pour les deux sexes, subdiviser aléatoirement chaque groupe en cinq flacons parallèles à une densité de 20 individus par flacon. Préparez une feuille de calcul de la durée de vie dans laquelle le nombre de mouches mortes est soustrait du nombre de mouches survivantes du transfert précédent, de sorte que le nombre de survivants à chaque transfert soit automatiquement obtenu. Après trois jours, transférer les mouches sans anesthésie sur de nouveaux flacons contenant les aliments correspondants en même temps et vérifier la mort.
Enregistrez l’âge des mouches et le nombre de mouches mortes. Répétez le transfert tous les trois jours jusqu’à ce que toutes les mouches meurent. Dans le cadre de cette expérience, les courbes de durée de vie ont été tracées comme la survie cumulative par rapport aux jours écoulés pour chaque concentration d’EDC et le contrôle.
Pour le contrôle, après une longue période initiale au cours de laquelle la courbe de survie est restée relativement élevée, elle a diminué de façon exponentielle après environ 60 jours. À la suite de l’exposition à EDC, la courbe de survie des mouches traitées a été affectée de façon significative et a connu une baisse spectaculaire après 36 jours. Il est informé que les flacons parallèles en cours d’analyse devraient être très similaires, sinon il sera difficile de comprendre lequel jeter.
Par conséquent, nous suggérons de prendre grand soin, en adoptant une bonne pratique expérimentale, en utilisant une grande taille d’échantillon. Suivant ces protocoles, il est également possible d’évaluer l’impact transgénérationnel d’un perturbateur endocrinien sélectionné ainsi que de tester les effets additifs potentiels d’une combinaison de différents perturbateurs endocriniens.
