중추 신경계에서 종양을 표적으로 하는 새로운 약물과 화합물을 개발하기 위해, 혈액-뇌 장벽을 통과하는 접근성과 통로는 매우 중요합니다. 화합물의 세포 독성치료 분자와 세포를 배양 하 여 쉽게 측정될 수 있지만, 그것은 정말 뇌의 종양 사이트에 실제 전달에 대 한 아무것도 말하지 않습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 접시에 체외에서 혈액 뇌 종양 장벽을 재현하는 방법을 설명하는 다음과 같은 프로토콜을 개발했다.
뮤린 또는 인간 기원의 불멸한 세포의 사용은 이 분석이 아주 유연하게 만듭니다. 또한 재현성이 높은 수십 개의 화합물을 쉽게 선별할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 전임상 모델을 진행하기 전에 화합물의 통로 및 표적화 능력의 정량화 및 시각화를 모두 가능하게 한다.
따라서, 당사의 방법은 미리 설정된 세포주를 사용하여 동물 모델을 부분적으로 대체합니다. 환자 유래 뇌종양 세포의 포함은 환자 이질성을 분석하며, 혈액-뇌 장벽을 확립하기 위해 불멸의 세포를 사용하면 결과의 재현성을 보장합니다. 전부, 이 혈액 두뇌 장벽 모형은 약 확산 또는 약 차량의 납품을 분석하기 위하여 정말 흥미로운 공구를 제공합니다.
이 방법의 시각적 데모는 삽입의 반대쪽에 있는 셀의 시드를 사용하여 다른 프로토콜에 자주 설명되지 않는 조작이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 삽입을 거꾸로 배치할 때 성상세포의 접착을 얻는 것은 시각적 표현의 이점이 매우 높습니다. 멸균 세포 배양 후드 에서, 조심스럽게 멸균 PBS의 5 밀리리터와 배양 된 성상 세포를 세척.
진공 펌프를 사용하여 PBS를 부드럽게 폐기하고 셀 을 분리하기 위해 5 분 동안 세포 해리 시약 2 밀리리터를 추가하십시오. 이어서, 멸균 완전 성상세포 배양 배지의 10밀리리터를 용기에 첨가하여 세포 해리의 활성을 억제한다. 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 분리된 세포를 용기에서 멸균 15밀리리터 튜브로 이송합니다.
원심분리기는 실온에서 3분 동안 250배 g로 합니다. 한편 인서트를 설정합니다. 멸균 집게를 사용하여 멸균 6웰 플레이트의 뚜껑에 뇌 측이 있는 인서트를 놓습니다.
원심분리가 완료되면 셀 서스펜션에서 상체를 조심스럽게 폐기하고, 튜브 벽에 펠릿을 최대 5회 파이프로 부드럽게 피펫하여 ABM 플러스의 1밀리리터로 성상세포 펠릿을 재놓습니다. 이어서, 세포를 카운트하고, 삽입당 ABM 플러스의 400 마이크로리터에서 세포 현탁액 밀도를 150, 000 세포로 조절한다. 세포 현탁액을 인서트 막의 뇌 측면 중앙에 놓고 멸균 파이펫 팁으로 모세관력을 사용하여 조심스럽게 퍼짐합니다.
인서츠의 뇌 측이 여전히 위로 올라가면 6웰 플레이트를 인서치에 다시 놓습니다. 플레이트와 인서트를 뇌 측위로 올려 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣고 세포 접착을 허용합니다. 그 후, 6웰 플레이트를 다시 정규 위치로 되돌리고, 인서트는 이제 혈액 측이 위로 올라간다.
매체를 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인큐베이션을 계속합니다. 멸균 세포 배양 후드 하에서, 멸균 PBS의 5 밀리리터로 배양 된 내피 세포를 조심스럽게 씻는다. 진공 펌프를 사용하여 PBS를 부드럽게 폐기하고 셀 을 분리하기 위해 5 분 동안 세포 해리 시약 2 밀리리터를 추가하십시오.
이어서, 세포 해리 시약의 활성을 억제하기 위해 혈관에 멸균 완전 내피 세포 배양 배지10밀리리터를 첨가한다. 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 분리된 세포를 용기에서 멸균 15밀리리터 튜브로 이송합니다. 원심분리기는 실온에서 3분 동안 250배 g로 합니다.
그 후, 상체를 버리고, 튜브 의 벽에 세포 현탁액을 5배까지 천천히 피펫으로써 EBM 플러스의 1밀리리터로 내피 세포 펠릿을 재연한다. 세포를 카운트하고, 세포 현탁액 밀도를 200, 000 세포로 조정하여 삽입당 혈청 및 혈관 내피 성장 인자-A가 없는 내피 세포 배양의 2.5 밀리리터에서 조정한다. 인서트가 포함된 플레이트를 검색합니다.
조심스럽게 혈액 측에서 매체를 버리고 내피 세포 현탁액의 2.5 밀리리터로 대체하십시오. 이어서, 플레이트를 인큐베이터로 돌려보내 내피 세포가 멤브레인에 부착할 수 있도록 하룻밤 을 둡니다. 다음 날, 미리 따뜻워진 ABM-마이너스 3밀리리터를 각 웰에 전송하여 6웰 플레이트를 준비합니다.
멸균 집게를 사용하여 인서트를 처리하여 혈액 측에서 내피 완전 배지를 조심스럽게 폐기하고 ABM-마이너스를 포함하는 새 플레이트에 삽입을 넣습니다. 그런 다음 EBM-마이너스 2.5 밀리리터를 추가합니다. 5 일 동안 최소한의 물리적 장애 또는 온도 변화로 인큐베이터에 인서트를 둡니다.
전송 당일, 매체를 교체하십시오. 면역 불광 이미징의 경우, 폴리 D-리신 2 밀리리터를 포함하는 6웰 플레이트의 각 웰에 최대 4개의 둥근 멸균 보로실리케이트 커버립을 배치합니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.
한편, 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 세포 배양 용기에서 종양 구체를 15밀리리터 멸균 튜브로 조심스럽게 이송한다. 3 분 동안 250 배 g에서 종양 구체를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 GBM-마이너스의 1 밀리리터로 구를 부드럽게 다시 중단합니다.
세포를 계산하고, GBM-마이너스의 밀리리터 당 약 10, 000 구 또는 100, 000 세포로 세포 밀도를 조절한다. 다음으로, 우물에서 폴리 D-리신을 버리고 멸균 PBS로 우물을 세 번 헹구십시오. 종양 스페로이드 현탁액의 3밀리리터로 플레이트의 각 웰을 시드하고, BBTB 모방을 종양 세포 현탁액으로 이송한다.
분석의 혈액과 뇌종양 측면이 평형에 올 수 있도록 이산화탄소 5 %와 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양. 다음 날, 혈액 측의 미디어를 분자, 약물 또는 나노 입자로 보충한 EBM-마이너스로 대체하십시오. 이전에 설명한 대로 직접 정량화를 위해 시간이 지남에 따라 샘플을 수집합니다.
먼저, BBTB 모방의 혈액과 뇌 측 모두에서 배지 100 마이크로리터를 수집하고, 후속 형광 측정을 위해 별도의 평평한 바닥, 검은 색, 96 웰 플레이트로 각각 전송한다. 다음으로, EBM-마이너스에서 플루오레세인 나트륨의 50 마이크로몰라 용액을 준비하여 우물당 2.5 밀리리터를 준비하십시오. 이 용액을 섭씨 37도로 미리 데우고, 삽입물의 혈액 측에서 미디어를 이 나트륨 형광액을 함유한 미디어로 대체한다.
매체를 교체하는 즉시 타이머를 시작합니다. 삽입물의 혈액과 뇌 측모두에서 5분, 30분, 60분, 120분 동안 100마이크로리터의 미디어를 조심스럽게 수집합니다. 각 샘플을 적절한 블랙, 96웰 플레이트의 우물을 분리하도록 전송합니다.
플레이트 판독기를 사용하여 수집된 샘플에서 형광을 정량화합니다. 첫째, 리소성 형광염을 미리 데운 매체에서 적절한 작업 농도로 희석한다. 이를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 45분 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다.
그런 다음, 얼음 차가운 PBS로 세포를 세 번 헹구는다. PBS를 폐기하고, 우물에 얼음 차가운 4% 파라포름알데히드 3밀리리터와 2.5 밀리리터를 삽입에 넣습니다. 10분 동안 얼음에 배양하세요.
그 후, 파라포름알데히드를 버리고 PBS로 세포를 세 번 헹구십시오. 증류수에서 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도에서 DAPI 용액을 사용하여 세포 핵을 제거하고, 세포 핵을 카운터스테인한다. 실온에서 7분간 배양하세요.
그런 다음 DAPI를 제거하고 증류수로 멤브레인을 세 번 세척합니다. 조심스럽게 멤브레인을 잘라 증류수를 제거하고 유리 현미경 슬라이드에 장착 매체의 한 방울에 놓습니다. 멤브레인의 반대편에 장착 매체의 또 다른 방울을 추가하고 조심스럽게 보로실리케이트 커버 유리로 덮습니다.
이 연구에서는, 내피 세포는 체외 설치에 있는 혈액 두뇌 종양 장벽 같이 인터페이스를 형성하기 위하여 성상세포와 공동 배양되었습니다. 뮤린 BBTB 모방의 공초점 화상 진찰은 bEND3에서 단단한 접합 단백질 구역 -1 및 claudin-5의 발현 및 세포 국소화를 보여줍니다. 내피 세포와 성상 세포 사이의 접촉은 bEND3 단배양에 비해 내피 세포-세포 접촉에 이 두 단백질의 재배치를 명확하게 유도한다.
뇌측에서 GFAP 발현 성상세포를 시각화하기 위해 면역형염색체 염색을 사용하여, 막을 통해 내피세포에 접촉하는 성상체 과정과 말발을 관찰하고 연구할 수 있다. 체외 BBTB 모방의 투과성 값을 체외 혈액-뇌 장벽과 비교하기 위해, 형광나트륨의 실시간 확산은 누드 마우스에 이식된 두개골 창을 통해 이미지화됩니다. 형광 스테레오 현미경을 사용하여, 주요 피알 혈관에서 파생되는 혈관 모세혈관으로부터의 형광 나트륨 확산은 프로브의 전신 주입 전, 도중 및 후에 기록된다.
환자 유래 교모세포종 구체를 표적으로 하는 나노 입자의 트랜스사이토시스는 이 BBTB 모방이 어떻게 혈액 측에서 뇌 측으로 화합물의 통과를 시각화하는 데 사용될 수 있는지 를 설명하기 위해 비교된다. NP110-관련 형광 신호는 내피 세포, 성상세포 및 종양 세포에서 리소좀과 공동 국한한다. 또한, NP110s는 내피 세포와 성상세포 사이에서 검출되어 삽입물의 막 기공을 통과한다.
NP110s의 전달은 혈액과 뇌 측 모두에서 수집된 샘플로부터형광을 측정하여 정량화되며, 이러한 값은 350나노미터인 결정된 나노입자와 비교된다. 볼 수 있듯이, NP110s만이 BBTB 모방을 교차할 수 있으며, NP350은 혈액 측에 남아 있어 이러한 나노 입자에 대한 투과성 값이 낮아집니다. 삽입을 조심스럽게 처리하고, 조심스럽게 멤브레인의 직접 접촉없이 삽입의 뇌 측에 성상 세포 현탁액을 확산.
멤브레인의 손상으로 인해 누출이 발생합니다. 이 방법은 말초 투여 페이로드의 뇌 전달의 질문에 대답하도록 조정할 수 있습니다. 더 큰 막 모공을 가진 다른 삽입을 사용하여, 세포 사치를 공부하는 것도 가능합니다.
이 기술은 다른 세포 유형을 사용하여 다른 세포 장벽을 모방하여 수정할 수 있습니다. 또한 항암 약물 검증에 사용되는 실험실 동물의 수를 줄이는 것을 목표로 보다 책임감 있고 윤리적인 연구의 길을 열어줍니다. 파라포름알데히드는 매우 독성이 있는 화학물질이며 그에 따라 처리해야 한다는 점을 기억하십시오.
또한 날카로운 메스를 사용하여 인서츠에서 멤브레인을 추출하는 동안주의하십시오.
