Al fine di sviluppare nuovi farmaci e composti che prendono di mira i tumori nel sistema nervoso centrale, l'accessibilità e il passaggio attraverso la barriera ematica-encefalica è molto importante. Sebbene la citotossicità dei composti possa essere facilmente misurata incubando le cellule con le molecole terapeutiche, in realtà non dice nulla sull'effettiva consegna al sito tumorale nel cervello. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato il seguente protocollo che descrive come ricreare la barriera tumorale e-encefalica in vitro su un piatto.
L'uso di cellule immortalate di origine murina o umana rende questo saggio molto flessibile. Può anche essere facilmente scalato fino allo schermo dozzine di composti ad alta riproducibilità. Inoltre, questo metodo consente sia la quantificazione che la visualizzazione del passaggio e la capacità di targeting dei composti prima di procedere con modelli preclinici.
Pertanto, il nostro metodo sostituisce parzialmente i modelli animali utilizzando le linee cellulari prestabilite. L'inclusione di cellule tumorali cerebrali derivate dal paziente dice l'eterogeneità del paziente, mentre l'uso di cellule immortalate per stabilire la barriera ematico-encefalica garantisce la riproducibilità dei risultati. Complessivamente, questo modello di barriera ematico-encefalica offre uno strumento davvero interessante per saggiare la diffusione del farmaco o la consegna di veicoli antidroga.
La dimostrazione visiva del metodo è fondamentale perché il seeding delle celle sul lato opposto dell'inserto richiede una manipolazione che non viene spesso descritta in altri protocolli utilizzando impostazioni simili. Ad esempio, ottenere l'adesione degli astrociti quando l'inserto è posizionato capovolto beneficia fortemente della rappresentazione visiva. Sotto una cappa sterile per la coltura cellulare, lavare accuratamente gli astrociti coltivati con cinque millilitri di PBS sterile.
Utilizzare una pompa per vuoto per scartare delicatamente il PBS e aggiungere due millilitri di reagente di dissociazione cellulare per cinque minuti per staccare le cellule. Quindi, aggiungere 10 millilitri di sterile mezzo completo di coltura cellulare astrocitale al vaso per inibire l'attività del reagente di dissociazione cellulare. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire le cellule staccate dal recipiente in un tubo sterile da 15 millilitri.
Centrifuga a 250 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, impostare gli inserti. Utilizzare forcep sterili per posizionare gli inserti con il lato cerebrale sul coperchio di una piastra sterile a sei pozzi.
Una volta completata la centrifugazione, scartare con cura il supernatante dalla sospensione cellulare e rimescolare il pellet di astrocita in un millilitro di ABM-plus tubazionando delicatamente il pellet sulla parete del tubo fino a cinque volte. Quindi, contare le celle e regolare la densità della sospensione cellulare a 150.000 celle in 400 microlitri di ABM-plus per inserto. Posizionare la sospensione cellulare al centro del lato cerebrale della membrana dell'inserto e diffonderla con cura usando la forza capillare con una punta sterile della pipetta.
Con il lato cerebrale degli inserti ancora in alto, riposizionare la piastra a sei pozzi sugli inserti. Posizionare la piastra e gli inserti, con il lato cerebrale verso l'alto, in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire l'adesione cellulare. Successivamente, ripristinare la piastra a sei pozzi nella sua posizione regolare, con gli inserti ora lato sangue verso l'alto.
Aggiungere il supporto e continuare l'incubazione come descritto nel protocollo di testo. Sotto una cappa sterile di coltura cellulare, lavare accuratamente le cellule endoteliali coltivate con cinque millilitri di PBS sterile. Utilizzare una pompa per vuoto per scartare delicatamente il PBS e aggiungere due millilitri di reagente di dissociazione cellulare per cinque minuti per staccare le cellule.
Quindi, aggiungere 10 millilitri di sterile mezzo completo di coltura cellulare endoteliale al vaso per inibire l'attività del reagente di dissociazione cellulare. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire le cellule staccate dal recipiente in un tubo sterile da 15 millilitri. Centrifuga a 250 volte g per tre minuti a temperatura ambiente.
Dopo questo, scartare il supernatante e rimescolare il pellet di cellule endoteliali in un millilitro di EBM-plus pipettando lentamente la sospensione cellulare sulla parete del tubo fino a cinque volte. Contare le cellule e regolare la densità di sospensione cellulare a 200.000 cellule in 2,5 millilitri di coltura cellulare endoteliale priva di siero e fattore di crescita endoteliale vascolare-A per inserto. Recuperate la piastra contenente gli inserti.
Scartare con cura il mezzo dal lato del sangue e sostituirlo con i 2,5 millilitri di sospensione cellulare endoteliale. Quindi, riportare la piastra all'incubatrice e lasciarla durante la notte per consentire alle cellule endoteliali di aderire alla membrana. Il giorno dopo, preparare una piastra di sei porvili trasferendo tre millilitri di ABM-minus pre-riscaldato ad ogni pozzo.
Utilizzando forcep sterili, maneggiare gli inserti per scartare con cura il mezzo completo endoteliale dal lato sanguigno e posizionare l'inserto nella nuova piastra contenente ABM-minus. Quindi, aggiungere 2,5 millilitri di EBM-minus. Lasciare gli inserti nell'incubatrice con minimo disturbo fisico o variazione di temperatura per cinque giorni.
Il giorno del trasferimento, sostituire il mezzo. Per l'imaging ad immunofluorescenza, posizionare fino a quattro coverlips di borosilicato sterile rotondo in ogni pozzo di una piastra a sei po porsi contenente due millilitri di poli-D-lisina. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Nel frattempo, utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire attentamente le sfere tumorali dal vaso di coltura cellulare a un tubo sterile da 15 millilitri. Centrifugare le sfere tumorali a 250 volte g per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare delicatamente le sfere in un millilitro di GBM-meno.
Contare le celle e regolare la densità cellulare a circa 10.000 sfere o 100.000 celle per millilitro di GBM-meno. Successivamente, scartare la poli-D-lisina dai pozzi e sciacquare i pozzi tre volte con PBS sterile. Seminare ogni pozzo della piastra con tre millilitri della sospensione dello sferoide tumorale e trasferire gli inserti con il BBTB imitare sulla sospensione delle cellule tumorali.
Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per consentire al sangue e ai lati del tumore al cervello del saggio di raggiungere l'equilibrio. Il giorno dopo, sostituire i media nel lato sanguigno con EBM-minus integrato con le molecole, i farmaci o le nanoparticelle di interesse. Raccogliere i campioni nel tempo per la quantificazione diretta come descritto in precedenza.
In primo luogo, raccogliere 100 microlitri del mezzo sia dal lato sanguigno che da quello cerebrale dell'imitazione BBTB e trasferirli ciascuno su una piastra separata a fondo piatto, nera, a 96 poggia-porsi per successive misurazioni della fluorescenza. Successivamente, preparare una soluzione di 50 micromolare di fluoresceina di sodio in EBM-minus, assicurandosi di preparare 2,5 millilitri per pozzo. Pre-riscaldare questa soluzione a 37 gradi Celsius e sostituire il supporto dal lato sanguigno degli inserti con mezzi contenenti questa soluzione di fluoresceina di sodio.
Avviare un timer non appena il supporto viene sostituito. Raccogliere con cura 100 microlitri di supporti sia dal lato sanguigno che da quello cerebrale degli inserti a cinque minuti, 30 minuti, 60 minuti e 120 minuti. Trasferire ogni campione in pozzi separati della piastra nera appropriata da 96 pozzi.
Utilizzare un lettore di lastre per quantificare la fluorescenza dai campioni raccolti. In primo luogo, diluire il colorante fluorescente lysosome all'appropriata concentrazione di lavoro in mezzo preri riscaldato. Aggiungere questo alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 45 minuti.
Quindi, sciacquare le cellule tre volte con PBS ghiacciato. Scartare il PBS e aggiungere tre millilitri di paraformaldeide ghiacciata al 4% ai pozzi e 2,5 millilitri all'inserto. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
Successivamente, scartare la paraformaldeide e risciacquare le cellule tre volte con PBS. Rimuovere il PBS e controsostenere i nuclei cellulari utilizzando una soluzione DAPI ad una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro in acqua distillata. Incubare a temperatura ambiente per sette minuti.
Quindi, rimuovere il DAPI e lavare le membrane tre volte con acqua distillata. Tagliare con cura la membrana, rimuovere l'acqua distillata e posizionarla su una goccia di mezzo di montaggio su uno scivolo al microscopio di vetro. Aggiungere un'altra goccia di mezzo di montaggio sull'altro lato della membrana e coprirla con cura con un vetro di copertura borosilicato.
In questo studio, le cellule endoteliali sono state co-coltivate con astrociti per formare un'interfaccia simile a una barriera tumorale emato-encefalica in una configurazione in vitro. L'imaging confocale della mimica BBTB murina mostra l'espressione e la localizzazione cellulare delle proteine di giunzione stretta zonula occludens-1 e claudin-5 in bEND3. I contatti tra le cellule endoteliali e gli astrociti inducono chiaramente il trasferimento di queste due proteine ai contatti cellula-cellula endoteliali rispetto alle monocolture bEND3.
Utilizzando la colorazione immunofluorescenza per visualizzare gli astrociti che esprimono GFAP sul lato cerebrale della membrana, è possibile osservare e studiare i processi astrocitici e i piedi finali che contattano le cellule endoteliali attraverso la membrana. Per confrontare i valori di permeabilità dei mimici BBTB in vitro con la barriera emato-encefalica in vitro, la diffusione in tempo reale della fluoresceina di sodio viene visualizzata attraverso una finestra cranici impiantata in topi nudi. Utilizzando un microscopio stereo a fluorescenza, la diffusione della fluoresceina di sodio dai capillari dei vasi sanguigni derivanti dai principali vasi sanguigni piali viene registrata prima, durante e dopo l'iniezione sistemica della sonda.
La transcitosi delle nanoparticelle che prendono di mira le sfere di glioblastoma derivate dal paziente viene quindi confrontata per illustrare come questo microfono BBTB possa essere usato per visualizzare il passaggio di composti dal lato sanguigno a quello cerebrale. Il segnale fluorescente associato all'NP110 si co-localizza con i lisosomi nelle cellule endoteliali, negli astrociti e nelle cellule tumorali. Inoltre, gli NP110 vengono rilevati tra le cellule endoteliali e gli astrociti, passando attraverso i pori della membrana dell'inserto.
Il passaggio degli NP110 viene quantificato misurando la fluorescenza da campioni raccolti sia dal lato sanguigno che da quello cerebrale, e questi valori sono confrontati con quelle nanoparticelle determinate che sono 350 nanometri. Come si può vedere, solo gli NP110 sono in grado di attraversare le imitazioni BBTB, mentre NP350 è rimasto sul lato sanguigno, con conseguente valori di permeabilità più bassi per queste nanoparticelle. Maneggiare l'inserto con cura e diffondere con cautela la sospensione cellulare dell'astrocita sul lato cerebrale dell'inserto senza contatto diretto della membrana.
Qualsiasi danno della membrana comporterà perdite. Questo metodo può essere adattato per rispondere alla domanda sulla consegna cerebrale di carichi utili amministrati periferici. Utilizzando diversi inserti con pori a membrana più grandi, è anche possibile studiare l'estravasazione cellulare.
Questa tecnica può essere modificata utilizzando diversi tipi di cellule per imitare altre barriere cellulari. Apre inoltre la strada a una ricerca più responsabile ed etica, con l'obiettivo di ridurre il numero di animali da laboratorio utilizzati per la convalida dei farmaci antitumorali. Si prega di ricordare che la paraformaldeide è una sostanza chimica molto tossica e deve essere maneggiata di conseguenza.
Inoltre, fai attenzione mentre usi un bisturi affilato per estrarre le membrane dagli inserti.
