이러한 프로토콜은 반복성 종양 세포 도전을 통해 키메라 항원 수용체 또는 CAR T 세포의 평가를 위한 장기간, 체외, 기능적 방법을 제공한다. 이 기술은 생체 내 CAR T 세포 기능 평가보다 시간이 적게 걸리고, 실제 항종양 효능을 정확하게 나타내면서 노동 집약적이다. 이 시험관 내 기술은 CAR T 세포 항종양 효능의 높은 처리량 스크리닝 및 분화를 가능하게 한다.
CAR T 셀 제품의 임상 적 효과를 평가하기위한 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 교모세포종 종양권 배양에서 교모세포종 종양스피어를 해리하는 것으로 시작합니다. 차가운 accutase의 1 밀리리터, 그리고 파이펫팅의 30~60 초.
종양권이 중단되었을 때, 따뜻한 공동 배양 배지의 5 밀리리터와의 반응을 중단하십시오. 그리고 원심분리에 의한 종양 세포 현탁액을 펠릿. 교모세포종 세포를 신선한 공동 배양 배지 농도의 밀리리터당 1.6배 10배, CAR T 세포 배양으로부터 수확한 T 세포를 동배배지 농도의 밀리리터당 CAR 양성 T 세포의 적절한 비율로 희석한다.
다음으로, 희석된 종양 세포의 100마이크로리터를 96개의 평평한 바닥 조직 배양 판의 각 웰에 추가한다. 그리고 CAR T 세포의 100 마이크로 리터는 부드러운 혼합과 종양 세포의 각 우물에. 그런 다음 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 놓습니다.
2일, 4일, 6일 배양시, 종양세포의 각 웰에서 50마이크로리터의 배지를 신중하게 제거하고, T세포 공동배양판은 표에 따라 재도전될 예정이다. 그런 다음, 50 마이크로리터의 신선한 교모세포종 세포 현탁액을 추가하여, 방금 시연된 대로 제조되었지만, 초기 공동 배양의 세포 수의 두 배로 부드러운 혼합을 통해 각각 잘 한다. 그리고 세포를 배양하는 배양에 접시를 반환합니다.
1일, 3일, 5일, 7일, 각 우물에서 상체를 새로운 96개의 둥근 바닥 플레이트로 옮기고, 사전 따뜻해지는 0.5%의 트립신 EDTA 50마이크로리터를 각 매체에 잘 고갈시켰다. 섭씨 37도에서 5분 후, 세포가 빛 현미경검사법에 의해 각 우물의 바닥에서 분리되어 있음을 확인하고, 세포를 재보습하기 위해 각 우물의 바닥 주위의 효소 용액을 부드럽게 피펫한다. 분리된 세포 현탁액을 새로운 96웰 플레이트의 적절한 해당 우물로 이송하기 전에.
원심분리에 의해 세포를 펠렛하고, 200 마이크로리터의 형광 활성 세포 선별 서용액또는 제2 원심분리로 잘 FFS로 세포를 세척한다. 4섭씨에서 30분 동안 잘 100마이크로리터의 SSS에 관심이 있는 항체 칵테일 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 인큐베이션의 종은 순차적으로 100 및 200 마이크로리터 FSS에 의해 임의의 언바운드 항체를 제거하고 DAPI 핵 얼룩 및 FSS의 100~200마이크로리터에서 세포를 재중단한다.
이어서, 표준 유량 세포 분석 프로토콜에 따라 세포를 분석한다. 종양 세포 공동 배양 후 CAR T 세포의 기능 및 phenotypic 분석을 위해, 유동 세포계로부터 데이터 파일을 검색하고, 모든 살아있는 DAPI 음성 세포를 게이트한다. 종양 세포를 정량화하기 위해 CD45 음성 집단을 게이트합니다.
CAR T 세포를 정량화하기 위해 CD45 양성 CAR 양성 인구에 게이트. 그런 다음 실험의 시간 경과에 걸쳐 종양 및 CAR T 세포 수를 플롯하여 41BB 및 CD69의 공동 발현에 의한 T 세포 활성화를 식별한다. CD45RO 및 CD62 리간드 발현에 의한 PD1, LAG3 및 TIM3 및 T 셀 메모리 상태 LAG3 및 T 셀 메모리 상태의 발현에 의한 T 셀 고갈.
CD45RO 및 CD62 리간드 식에 의해. CD4 양성, 및 CD8 양성 CAR T 세포모두 CD107a 및 세포 내 사이토카인 발현에 의해 표시된 바와 같이 표적 항원을 발현하는 교모세포종 세포에 대해 동등하게 활성화된다. 그러나, 반복적인 종양 도전 SA에 의해 평가된 바와 같이, CD4 양성, CD8 양성, CAR T 세포는 다중 원형 살수 수 있다.
CD4 양수 CAR T 셀도 보다 견고한 확장을 달성합니다. CD4 양성 및 CD8 양성 CAR T 세포가 1 대 1 비율로 혼합될 때, 이 세포 조합은 CD8 양성, 그러나 장기 세포 독성 의 관점에서 CD4 양성 CAR T 세포를 수행한다. 또한, CD8 양성 CAR T 세포의 팽창은 CD4 양성 T 세포의 첨가에 의해 유도된다.
CD4 양성 CAR T 세포 팽창은 CDa 양성 세포의 존재에서 억제된다. 초기 공동 배양 후 24시간, CD4 양성 및 CD8 양성 CAR T 셀 모두 유사하게 활성화된다. 반복종양 도전 중, CD4 양성 및 CD8 양성 CAR T 세포 모두 CD45RO 양성, CD62 리간 양성 중앙 메모리 표현형, CD45RO 양성 CD62 리간 음성 이펙터 메모리 표현형으로의 전환을 입증한다.
CD8 양성 CAR T 세포는 또한 공동 배양 3일 후에 PD1, LAG3 및 TIM3 발현에 의해 평가된 CD4 양성 CAR T 세포에 비해 피로하는 경향이 있습니다. 또한, CD4 양성 T 세포의 존재 또는 부재에서 CDa 양성 CAR T 세포 고갈에서 관찰된 차이가 없으며, CD4 유도CD8 양성 CAR T 세포 팽창이 더 나은 이펙터 기능과 연관되지 않음을 나타낸다. 이 에세이는 또한 T 세포를 분류하는 것과 결합하여 전사, 프로테오믹스 및 관심있는 특정 유전자에 대한 추가 분석을 수행하기 위해 공동 배양을 형성할 수 있습니다.
이 반복적인 종양 도전은 또한 CAR T 세포 종양 인식 후 생물학 사건을 조사하기 위한 플랫폼으로 이용될 수 있었습니다.
