Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF), 프로젝트 아니오 투자 되었다. 난 ERANET 프로젝트에서 변환 암 연구 (TRANSCAN) "으로 전립선 암 (CTC-스캔)에 있는 최소 잔여 질병 바이오 마커 순환 종양 세포"의 일환으로 (추 신)을 1220 B19. 박사 학위 후보자 사우스 캐롤라이나 의료 그라츠 대학교의 박사 학위 프로그램 분자 의학의 프레임 내에서 훈련 되었다. 저자는 기꺼이 그들의 전문 기술 지원에 대 한 니 나 Schlögl, 다니엘 Kummer, Gabi Wendt, 클 라우 디 아 Chudak, 줄리아 슐츠, 그리고 요한 나 쉴러 인정합니다. 저자는 게오르그 Peinhaupt 그래픽 디자인 지원 감사.

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	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Gorges, T. 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저자는 공개 없다.

설명된 프로토콜은 단일 셀 비보 전 게놈 분석을 위한 기능성된 와이어 (장치 라고도 함)에서 셀을 검색 목표로 합니다. 우리 테스트 3 EpCAM 양성 세포 선 (HT-29, LNCaP, 및 VCaP), 하지만 원칙적으로이 방법은 EpCAM 표현 모든 셀 라인에 적용할 수 있습니다. EpCAM 긍정적인 대상 셀 순수 셀 서 스 펜 션 장치를 발표 될 수 있다 (2.1 참조) 또는 배경 셀의 흑자에 혼합 (예. 주변 혈액, 2.2 참조.). 특히 후자의 격리 용량 드문 셀 조건에서 테스트를 사용할 수 있습니다, 반면 와이어에 연결 된 셀의 수의 미세 조정 할 수 있습니다 설명된 낮은 볼륨을 사용 하 여 접근 (2.3 참조.). 로 셀 라인 간의 차이 예상 될 것 이다, 와이어, 회전을 충전을 위한 적당 한 셀 밀도 속도 뿐만 아니라 보육 시간 면역 형광 현미경을 사용 하 여 연결 된 셀의 수를 계산 하 여 경험을 테스트 될 필요가.
단일 셀 수준 WGA에서 게놈 다운스트림 응용 프로그램에 대 한이 필요 합니다. WGA 방법의 선택 실험실 사이 다를 수 있습니다 그리고, 원칙적으로, 우리의 메서드는 micromanipulation 또는 레이저 기정에서 얻은 샘플을 처리할 수 있는 보다 모든 방법에 열려. 이 프로토콜 열-조각화 기반 WGA7에 비해 더 나은 성능으로 인해 효소 조각난된 DNA 기반 방법을 사용 하 여. 옵션, 단일 셀 수 있도록 후속 DNA 프로 파일링20,21등온선 WGA에 전달할 수 있습니다.
설명된 프로토콜 게놈 단일 세포 분석을 위한 기능성된 와이어의 새로운 세대에 연결 되 고 후 그대로 세포 회복을 목표로 합니다. 또한 지금까지 시장에서 vivo에서 만 CE 승인 농축 장치, 대표 기능성된 와이어의 첫 번째 세대 열거 하는 CTCs 전이 암 환자에서 사용 되었다. 이전 게시 하 고 우리 자신의 데이터 현재 골드 표준 기술2에 비해 더 민감한 vivo에서 의 절연 기술을 제안 합니다. 따라서, 장치에서 실현이 비보에 격리 기술을 복구 기능을 갖춘 단일 세포 수준에서 묘사와 높은 CTC 복구를 결합 수 있습니다.
그러나, 장치에 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다, 그리고 따라서, 임상 데이터는 사용할 수 없습니다. Ex vivo 응용 프로그램 (즉, 샘플링 후 CTCs 주변 혈액에서 분리) 기술은 이다 cubital 헛된, 예를 들어 낮은 직경 헛된 (증가의 확률의 현재 설정에 적응에 권장 하지 않습니다 CTCs과 잡기 항 체 사이 접촉을 직접) 및 긴 보유 시간 (30 분, 와이어를 통과 하는 혈액의 2-3 L을 허용). 그러나,에 개요 섹션 2.2로. 대상 셀 혼합된 샘플7으로부터 격리 될 수 있습니다.
방법의 현재 한계는 전선에서 분리 후 고정 되지 않은 셀의 비효율적인 회복 이다. 그러나 이것,, 분리 처리 이전 셀 고정 단계에 의해 향상 될 수 있습니다.
요약 하자면,이 프로토콜은 유전자 단일 셀을 특성화에 대 한 사용은 vivo에서 격리 기법 셀 복구를 향한 첫 번째 단계입니다. 셀 복구 및 환자1,2에서 응용 프로그램에 대 한 허가의 최적화를 해결 하기 위해 더욱 노력 해야 합니다. 그러나, 치료 모니터링 및 치료 결정에 대 한 맞춤된 의학 CTCs 열거 벗어납니다. 따라서,이 메서드는 단일 세포 수준에서 게놈 CTC 특성화 향한 첫 번째 단계.
단일 셀 transcriptome 분석으로 응용 프로그램 것으로 그대로 세포 수확 가능. 그러나, 그것은 회복 절차 (예: 실시간 정량22뒤 직접 세포에 복구 된 단일 셀을 전달) RNA 무결성에 영향을가지고 있는지 평가 하 남아 있다. 성공 하면, 단일 셀 (예: CTCs)의 특성화 transcriptome 수준, 더 자세한 분석을 허용 하 이동 수 있습니다. 이 점에서 RNA-seq로 양이 많은 PCR에 (RNA-seq 라이브러리 준비 하는 동안 얻은) preamplified cDNA를 대상이 될 수 있는 단일 세포의 RNA 다운스트림 분석을 위한 유용한 도구를 제공 스마트 seq2를 사용 하 여. 이 결합된 대상 및 단일 복구 된 셀22,23의 심사 기반 분석을 허용할 것 이다.
현재 기능성된 와이어 CTCs24의 긍정적인 선택에 대 한 널리 상피 마커는 안티 EpCAM 항 체를 기반으로 합니다. 여러 CTCs 수도 cytokeratins 등 EpCAM25downregulate 상피 마커, HER2/새 등 항 체를 추가 CTC 절연의 기회를 증가할 것입니다. 여러 가지 항 체 농축 전략 개발 되었고 페 레이 외의 검토를 기반으로 합니다. 201626에. 와이어에 움직일 항 체의 혼합물 더 높은 숫자의 격리 및 추가 하위 CTCs의 기술의 미래 향상 될 수 있습니다.
그것은 그것의 기능을 유지 하기 위해 솔루션에 빠져들 와이어의 기능적인 부분을 계속 처리 하는 와이어를 포함 하는 모든 단계에 대 한 필수입니다. 평가 (현미경; 중 1 x PBS에 와이어를 배치 하는 것이 좋습니다. 예. 3.1 단계. -3.3.) 그리고 저장입니다. 부적절 한 얼룩을 피하기 위해 갓을 사용 하 여 단계 1.2.1 얼룩 솔루션을 준비 하는 것이 좋습니다. 1.2.2 하 고입니다. 약하게 스테인드 셀 셀에 계산을 방해 하 고 연결 된 셀의 과소를 이어질 수 있습니다.
그것은 고무 캡으로 파스퇴르 피 펫 파스퇴르 피펫으로 세포 현 탁 액 (단계 2.3.4.)의 후속 로드에 와이어를 삽입할 때 연결 하지 않도록 해야 합니다. 고무 캡 기능 부분 파스퇴르 피 펫의 끝 안에 위치 하 고 자리에는 와이어를 잡고 하는 데 사용 됩니다. 뚜껑 파스퇴르 피 펫의 후면에 너무 단단히 연결, 세포 현 탁 액의 로드 불가능 합니다. 이 경우에 로드 셀 서 스 펜 션에 의해 전치 되는 공기는 피 펫을 남길 수 있습니다 뚜껑을 쉽게.
와이어 벤딩 하는 것은 단계 3.2에서 셀 동안 그것의 방향에 대 한 중요 합니다. 그리고 3.3입니다. 와이어 철사의 비 기능 끝 한쪽에 거짓말을 제공 되도록 접착 테이프를 사용 하 여 탑재 합니다. 스캔 후 기능 부품의 전체 길이, 와이어는 압 연 180 ° 그래서 기능 와이어의 나머지 절반을 검색할 수 있습니다. 이 단계는 초기 실험에는 셀의 수를 평가 하는 것이 중요. 일단 특정 셀 라인 및 절차에 대 한 셀의 수 계산 절차 셀 계산 없이 반복 될 수 있다 (예.만 셀의 존재에 대 한 검사 또는이 단계 생략). 주의 pipetting 손실을 방지 하기 위해 셀 단계 4.8에서에서 상쾌한의 볼륨을 감소 때 결정적 이다. 펠 릿에 소란 없이 원활 하 게 이루어집니다 pipetting 다는 것을 확인 하십시오.

최근, CellCollector DC01, 의료 와이어 기능성된 암 환자의 말 초 혈액에서 CTCs를 격리 하기 위한 안티 EpCAM 항 체와 CTC 열거형1,2,3의 조직적 스펙트럼에 추가 되었습니다. . 비 전이성 전립선 암에는 현재 진행 중인 연구,이 기능성된 와이어 CTC 양성 되도록 거의 두 배나 많은 환자를 보고 하 고 CellSearch, CTC 열거형3 황금 표준에 비해 CTC 양성 환자에서 높은 CTC 계산 . 이 격려 성능으로 인해 단일 세포 분석을 위한 기능성된 의료 와이어에서 셀의 격리, 바람직한 것 하지만 셀 분리 솔루션 (예: trypsin) 효소 치료도 아니다 아니 레이저 기정 그대로 셀 (데이터 표시 되지 않음)의 복구.
허용 하려면 캡처된 세포의 분리, 기능성된 와이어의 새로운 세대는 특정 폴리머로 갖춰 졌다. 이 폴리머는 와이어를 캡처 항 체를 연결 하는 그대로 셀 (CellCollector DC03 라고도 장치)의 분리를 허용 릴리스 버퍼 치료를 받기 쉽습니다. 암 셀 라인 셀 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 아군의 다양 한 농도에서 대상 셀의 격리를 허용 하는 새로운 기능성된 장치 / 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 말 초 혈액, 각각.
편하게 하기 위해 셀의 시각적 탐지 장치 및 복구 후, 대상 암 세포는 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)와 회복 치료 전에 DNA 얼룩 셔 서 (즉. 충전 및 분리). 단일 세포의 DNA 품질에 대 한 치료의 효과는 품질 관리 PCR4,5, 배열 CGH6,7 에 의하여 WGA 후 이전 평가 했다 및 타겟 시퀀싱7 아무 차이 보여주는 셀 정지7에서 치료 비 셀 micromanipulated에 비해. 이 방법의 장점은 단일 셀 다운스트림 분석 (그림 1)에 대 한 세포의 복구와 희귀 대상 셀 사전 농축의 조합에 있다. 수집 장치 vivo에서 CE 표시 현재는 단일 셀 분자 특성2,8보다 CTCs의 열거에 대 한 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, CTCs 가운데이 조사 하기 위해 보다 포괄적인 분석 개별 셀 수준 (즉, 타겟 시퀀싱 단일 셀 수준)에서 분석에 대 한 긴. 다른 셀 기반 방법 EpCAM 긍정적인 CTCs 및 후속 분자 유전 분석9,10dielectrophoresis에 따라 단일 셀 처리의 immunomagnetic 격리를 기반으로 합니다. CTCs의 분자 특성 임상 설정에서 그들의 유용한 구현 위한 중요 한 요구 이며 전이성 캐스케이드의 기초 연구에서 똑같이 중요 하다. 최소한의 기술 격리 절차11,12종양의 DNA 분석 수 CTCs에 평행선, 순환 종양 DNA (ctDNA) 매우 중요 되고있다. 셀 기반 접근 RNA13,14 및 단백질15 식 분석에 대 한 수는 상호 보완적인 기여 역할을 수 있습니다 및 또한 CTC 파생 셀 문화 또는 xenografts16, 17. 비록 낮은 셀 복구 및 환자에 사용에 대 한 허가 등 장애물을 해야, 캐치 및 릴리스 메서드 희귀 대상 셀의 특성으로 중요 한 다음 단계 걸립니다.

<table><tbody><tr><td>Gilupi Release Buffer</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>Used to detach cells from the wire</td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>Supplement for McCoy&#039;s 5A Medium</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Supplement for McCoy&#039;s 5a Modified Medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>Supplement for McCoy&#039;s 5a Modified Medium</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Cell detachment solution (cell culture)</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>Type 1003</td><td>Used for prewarming solutions</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Used to incubate cells (cell culture)</td></tr><tr><td>50 mL reaction tubes</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Roller mixer</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td></tr><tr><td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Used for pelleting cells</td></tr><tr><td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td></td><td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Used for coating glass/plastic surfaces</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>Used for vortexing</td></tr><tr><td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td><td>BD</td><td>366450 (or 366480)</td><td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&amp;amp;release, C&amp;amp;R)</td></tr><tr><td>Syringe needles (G20)</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&amp;amp;R to lead through it</td></tr><tr><td>Neubauer chamber</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>Used to count cells</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Used for the low-volume application of cells to the C&amp;amp;R</td></tr><tr><td>Grease pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td></tr><tr><td>Steril syringe filter (0.2 &amp;micro;m)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Used for agitation during cell detachment</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Kit</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td>To be ordered via Silicon Biosystems</td></tr><tr><td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Use micromanipulation at hand</td></tr><tr><td>Microcapillaries (25 &amp;micro;m in diameter), CustomTip Type I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Used for micromanipulating cells</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge and equippment</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Use cytocentrifuge at hand</td></tr><tr><td>Thermo cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Use desk-top centrifuge at hand</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Use DNA cross linker at hand</td></tr><tr><td>Standard PCR reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6x DNA Loading</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Use gel loading dye at hand</td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Use 100 bp ladder at hand</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Gel electorphoresis station</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Use electrophoresis system at hand</td></tr><tr><td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td></tr></tbody></table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

드문 대상 셀 대상 세포의 표면 단백질에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 비 대상 셀의 높은 배경 으로부터 격리 될 수 있습니다. 최근에 개발 된 방법 안티 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 순환 종양 세포 (CTCs)1의 비보에 격리에 대 한 항 체와 기능성된 의료 와이어를 사용 합니다. 비 전이성 전립선 암에 일치 하는 환자 코 호트 vivo에서 절연 기술 CTCs CTC 열거형의 현재 황금 표준에 비해 높은 CTC 카운트에 대 긍정적인 환자의 높은 백분율에서 결과 나타났다. 으로 셀은 현재 의료 기기에서 복구할 수 없습니다, (장치 라고도 함)는 새로운 기능성된 와이어 제조 되었다 캡처 및 셀의 후속 분리 효소 처리에 의해. 셀 장치, 현미경에 시각 및 효소 처리를 사용 하 여 분리를 첨부할 수 있습니다. 복구 된 세포 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 이며 레이저 서 또는 micromanipulation 개별적으로 수확. 단일 셀 샘플 검사 및 대상별 접근을 포함 하 여 여러 다운스트림 분석을 허용 하는 단일 셀 전체 게놈 증폭 다음 대상이 됩니다. 격리 및 복구의 절차 고품질 DNA 단일 세포에서 생성 하 고 후속 전체 게놈 증폭 (WGA)을 손상 하지 않습니다. 단일 셀의 증폭 된 DNA 검사에 전달 될 수 있습니다 또는 배열 비교 게놈 교 잡 (배열 CGH) 또는 시퀀싱 등 분석 대상. 장치 인공 드문 셀 샘플 (즉 500 아군 주변 혈액 5 mL에는 대상 셀)에서 ex vivo 격리를 수 있습니다. 슬라이드에 분리 된 세포의 복구 속도 광범위 사용 셀 라인에 걸쳐 세포의 분리 요금은 허용 (50-90%), 반면 (< 10-> 50%)와 몇 가지 더 주의가 필요 하다. 이 장치는 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다.

CFSE와 핵 얼룩 후 셀 DAPI FITC에 대 한 필터를 장착 하는 면역 형광 현미경을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 반면 셀의 세포질 이기종 간 세포 농도 (그림 2A 및 2E) CFSE와 균일 한 라벨 핵 DAPI 채널에 밝은 counterstain 제시. 비슷한 모양 및 강렬을 얼룩이 지 와이어 (그림 2B 와 2 층)에 연결 된 셀에서 예상으로 전선에서 분리 있으며 슬라이드 (그림 2D 및 2 H)에 복구.
높은 세포 밀도 (예 > 1000000 셀/mL) 전선을 충전 셀 와이어의 전체 범위에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 낮은 세포 밀도, 인큐베이션, 동안 회전 속도 변화 및 다른 세포를 사용 하 여 분리 효율에 영향을 별도로 테스트 하는 데 필요한. 때 전선을 했다 인 큐베이 팅 100 000에 HT-29 셀의 5 mL와 셀 / mL으로 섹션 2.1에서에서 설명., 254 ± 103 셀의 평균 (n = 5) 철사에 체포 되었다. 같은 실험 LNCaP 셀, 440 ± 319 셀의 평균을 사용 하 여 (n = 5) 와이어 당 획득 했다.
75 ± 18, 25 ± 9 셀 전지와 47 ± 57 셀의 캡처 귀착되 었 다 (에 따르면 프로토콜 섹션 2.2.) 전선 주변 혈액 5 mL의 배경에서 500, 5 000, 50 000 HT-29 세포 (n = 3, 각각), 각각. 와이어 15 µ L 섹션 2.3에서에서 프로토콜에 따라 세포 현 탁 액 (1000000 셀/mL)의 비용이 청구 됩니다 경우., 1 000 (HT-29)까지 셀 철사에 첨부할 수 있습니다.
HT-29 셀에 81%에서 배열 했다 분리 효율성 셀 (범위 54.9%-93.2%, 및 n = 5) 81% (범위 63.51-92.87%, n = 6) 91% (범위 84.7%-95.3%, n = 6) LNCaP 시내 VCaP 세포, 각각. 마찬가지로, 분리 된 세포의 복구 셀 라인 다릅니다: 분리 된 HT-29 셀의 28%의 평균 cytocentrifugation에 의해 재기 되었다. LNCaP에 대 한 회복 율 10% 미만인 반면, VCaP 셀에 대 한 평균 복구 율은 55%.
단일 셀의 약 75%에 WGA 수확량 고품질 WGA 제품 복종: 이것이 1) > 1 kb (그림 4, 맨 위 패널)와 2) 3 0.1에서 배열 하는 WGA 제품의 얼룩 또는 4 밴드 4plex 품질에서 제어 PCR (그림 4, 하단 패널) . WGA 제품에 대 한 1) 배열-CGH 다시 증폭 WGA 7후 단일 셀 배열 CGH 프로필 6,7 과 2) 타겟된 NGS에 대 한 품질 기준에 부합 하는 프로 파일링을 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> 그림 1: 분리 하 고 복구 하는 단일 세포 분석에 대 한 대상 셀에 대 한 워크플로. (A) 세포 90 %confluency 교양 하 고 (B) 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 수확. 기능성된 와이어 CFSE와 핵 얼룩, (C) 얼룩 후를 incubated 5 mL 반응 관을 사용 하 여 볼륨 또는 낮은 볼륨 파스퇴르 피 펫 팁을 사용 하 여 셀의 존재. 후자의 수 있습니다 셀 서 스 펜 션의 응용 프로그램에 대 한 낮은로 15 µ L. (D) 셀 충전 후 4 시간 이내 분리할 필요가. 따라서, 와이어 릴리스 버퍼 가득 1.5 mL 반응 관에 배치 됩니다. 15 분 보육 로커에 10 분 원심, 후 철사를 제거 하 고 세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 centrifuged. (E) 복구 세포는 중 단일 셀 micromanipulation (맨 위) 또는 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 유리 슬라이드에 전송 하 고 서 (아래)를 레이저로 전달. (F) 마지막으로, 수확된 단일 셀은 전체 게놈 증폭 (WGA)에 의해 증폭 됩니다. WGA 제품 배열 CGH 및 타겟된 NGS 다운스트림 분석과 호환 됩니다. EpCAM epitope: 세포 표면에 녹색 원. 와이어 기능성: 장치, 회색 트리플-나선형 와이어. 폴리머: 보라색 라인입니다. 안티-EpCAM 항 체: 오렌지. 버퍼 활동 발표: 빨간 화살표. 장소에 세포 현 탁 액을 그리스 마커: 다크 블루 타원. 세포 현 탁 액을 복구: 밝은 파란색. Micromanipulation에 대 한 모 세관: 블랙 라인. 확대: 복구 된 셀 micromanipulation에 의해 수확에 막 덮여 cytospin 슬라이드 포함 복구 세포 (회색 채워진된 타원). 확대: microdissected 레이저 복구 된 셀 되 (원형 선 회색: 막 슬라이드 레이저 서 위한 등뼈로 봉사에서 막), 레이저 빔 (파란색 선 막 슬라이드를 아래에서 접근)으로. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> 그림 2: 시각화 이라는 셀. (A, E) 충전 하기 전에 셀: 셀 CFSE와 표시 및 dna 염료 CFSE의 범위 (녹색) 신호 강도 보여주는 intercalating counterstained. (B,F) 통신 중에 캡처한 이라는 셀. (C,G) 휴대-분리 절차 후 와이어. (D,H) 셀은 와이어에서 분리 하 고 슬라이드에 cytocentrifugation에 의해 발견. CFSE: FITC 채널 (녹색)입니다. DNA 얼룩: DAPI 채널 (파란색). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> 그림 3: 와이어 및 스토리지 구획. 와이어의 (A) 구획. (B) 기능성된 부품의 세부 사항. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> 그림 4: 단일 micromanipulated 세포에서 얻은 WGA 제품의 품질 관리. 상단 패널: 단일 세포에서 얻은 WGA 제품 일반적으로 DNA에 결과 얼룩 피크 강도 약 0.5 k b에 0.2 kb에서 > 1.0 kb에 이르기까지. 샘플 번호 1, 7, 13 차선 표시 (별표 표시) 또는 아무 DNA 얼룩. 하단 패널: WGA 제품은 충분 한 품질의 4plex PCR 수익률 3 또는 4 4 PCR 제품의 경우 (100, 200, 300, 그리고 400에 bp). 예제 1, 7, 10, 및 13 3 밴드를 표시 하 고 추가 분석에서 제외 될 것 이다. 레인 M 100 bp 사다리를 포함 하 고 별표 부족 WGA 제품 품질의 샘플을 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>뇌관 순서</td>
			<td>참고</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gtt cca ata tga ttc cac cc-3</td>
			<td>100 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3</td>
			<td>100 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tgg agc gct agc-3 ' 개 그</td>
			<td>200 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3</td>
			<td>200 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tga gac att ctt gct gg-3</td>
			<td>300 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' tcc 법 aac cag tca gcg tc-3</td>
			<td>300 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc 고양이 gcc atc 법 gc-3</td>
			<td>400 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gct tga caa agt ggt cgt 안내-3</td>
			<td>400 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 4plex 품질 관리 PCR 뇌관 순서

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Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

target-cell-pre-enrichment-whole-genome-amplification-for-single-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.8K 조회수.  Medical University of Graz. 이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

연구

유전학

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

단일 셀 Transcriptome 분석

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

신경과학

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic marks in a single cell and requiring data from other cells to distinguish signal from experimental background noise in a single cell. This paper describes a method to reuse the same single cell for iterative epigenomic analyses. 
In this experimental method, cellular proteins are first anchored to a polyacrylamide polymer instead of crosslinking them to protein and DNA, alleviating structural bias. This critical step allows repeated experiments with the same single cell. Next, a random primer with a scaffold sequence for proximity ligation is annealed to the genomic DNA, and the genomic sequence is added to the primer by extension using a DNA polymerase. Subsequently, an antibody against an epigenetic marker and control IgG, each labeled with different DNA probes, are bound to the respective targets in the same single cell. 
Proximity ligation is induced between the random primer and the antibody by adding a connector DNA with complementary sequences to the scaffold sequence of the random primer and the antibody-DNA probe. This approach integrates antibody information and nearby genome sequences in a single DNA product of proximity ligation. By enabling repeated experiments with the same single cell, this method allows an increase in data density from a rare cell and statistical analysis using only IgG and antibody data from the same cell. The reusable single cells prepared by this method can be stored for at least a few months and reused later to broaden epigenetic characterization and increase data density. This method provides flexibility to researchers and their projects.

The present protocol describes a single-cell method for iterative epigenomic analyses using a reusable single cell. The reusable single cell allows analyses of multiple epigenetic marks in the same single cell and statistical validation of the results.

반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

면역학 및 감염병학

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

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생체공학

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying cell composition, discrimination of functional states, and molecular pathways underlying observed tissue functions and animal behaviors. However, the isolation of intact, healthy single cells from adult mammalian tissues for subsequent downstream single cell molecular analysis can be challenging. This protocol describes the general processes and quality control checks necessary to obtain high-quality adult single cell preparations from the nervous system or skin that enabled subsequent unbiased single cell RNA sequencing and analysis. Guidelines for downstream bioinformatic analysis are also provided.

This protocol describes the general processes and quality control checks necessary for preparing healthy adult mammalian single cells for droplet-based, high throughput single cell RNA-Seq preparations. Sequencing parameters, read alignment, and downstream single-cell bioinformatic analysis are also provided.

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생물학

마우스 경동맥의 2단계 세포 분해

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are clogged by plaque. Revealing the cellular composition of the carotid artery at the single-cell level is essential for treating carotid atherosclerosis. However, there is no ready-to-use protocol for the preparation of single-cell suspensions from carotid arteries. To obtain a suitable protocol for the dissociation of normal carotid arteries at the single-cell level with less damage to cells, we designed a two-step digestion method by integrating the digestion process of collagenase/DNase and trypsin. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, a median of ~2500 transcripts per cell were detected in each carotid artery cell. Notably, a variety of cell types of the normal carotid artery, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were concurrently detectable. This protocol may be applied to prepare a single-cell suspension of blood vessels from other tissues with appropriate modifications.

저자 스포트라이트: Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy 

Here we describe a two-step cell digestion protocol for preparing a single-cell suspension of mouse carotid arteries.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

요약

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Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

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