우리는 최근에 LCK GFP 제브라피쉬에 있는 많은 B 세포가 GFP의 낮은 수준을 표현하는 다는 것을 것을을 발견했습니다. 이것은 이 줄을 T 세포뿐만 아니라 B 세포를 연구하기위한 유용한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 지금 우리가 LCK GFP 제브라피시에서 B 세포와 T 세포를 공부할 수 있고 암에 있는 물고기에서 B-ALL 및 T-ALL 세포를 공부할 수 있다는 것입니다.
이러한 방법을 통해 제브라피시에서 B 세포 개발 및 B-ALL 연구를 가능하게 합니다. 적응형 면역 체계를 이해하는 데 관련이 있으며 소아암에서 흔히 볼 수 있는 악성 종양입니다. 좋은 흉선과 골수 샘플을 얻을 수 있을 때까지 기술을 몇 번 구체화하려는 경우가 있습니다.
시각적 데모는 시청자가 물고기에서 불소와 B-ALL을 인식하고 격리를 위해 B 및 T 셀을 분리하기 위한 올바른 설정을 선택하는 데 도움이 됩니다. 물고기 시스템에서 0.02%의 트리카인을 마취한 후 지분 내측 양상에서 형광 티미에 대한 2~6개월 된 제브라피시를 검사하기 위해 상피성 현미경에 GFP 필터를 사용합니다. 흉선을 찾은 후 페트리 접시에 안락사 된 생선을 배치하고 형광 현미경을 사용하여 GFP 긍정적 인 티미를 제거합니다.
그리고 신장 골수와 비장을 수확하는 밝은 필드 현미경 검사 설정. 수집된 각 장기를 1.5 밀리리터 튜브에 놓고 500마이크로리터의 냉기 선별 매체를 포함하고 유봉 마이크로튜브 균질화기를 사용하여 얼음에 있는 조직을 균질화합니다. 이어서, 35 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 균질화된 조직을 변형하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포를 얼음 위에 놓습니다.
2~4개월부터 는 형광 현미경을 사용하여 이중 형질성 rag2:hMYC LCK EGFP 물고기를 낮은 노출 설정을 사용하여 밝은 T 세포 급성 림프구성 백혈병 또는 T-ALL 및 고노출 설정을 식별하여 희미한 B-ALL 동물을 식별합니다. 야생형 조절및 백혈병 전 물고기는 GFP가 흉선에서만 국한되어 있다. 간단한 세 가지 범주 시스템을 사용하여 GFP 형광의 정도를 기준으로 물고기를 분류합니다.
레벨 1 물고기는 제한된 국소 확산을 가진 흉종양으로 형광 신호를 보여줍니다. 레벨 2 물고기는 신체의 50 % 미만을 포함하는 흉선 너머의 형광 신호를 보여줍니다. 그리고 레벨 3 물고기는 신체의 50 %를 넘어 확장 형광 신호를 보여줍니다.
모든 물고기와 모든 것을 암이없는 것과 분리하십시오. 그리고 새로운 ALL의 발달을 위해 매월 한 번 GFP 양성 종양없이 전 백혈병 물고기를 모니터링한다. T 또는 B-ALL 셀 절연의 경우 면도날을 사용하여 안락사 된 레벨 3 물고기의 머리와 흉선 부위를 제거하고 시체를 페트리 접시에 넣습니다.
P-1000 파이펫을 사용하여 500마이크로리터의 냉기 선별 매체로 물고기 복막 구멍을 세척하여 5밀리리터 튜브에서 세포와 배지를 수집합니다. 신선한 파이펫 팁을 사용하여 2-3마이크로리터 부피를 체공에 넣고 파이펫 끝을 사용하여 체내에서 세포를 5밀리리터 튜브로 돌출합니다. 그런 다음 35 마이크로리터 메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 변형시보도록 합니다.
그리고 세포 측정을 유동하여 분석 할 때까지 세포를 얼음에 놓습니다. 전신 균질화를 위해 유봉 마이크로튜브 균질화제를 사용하여 물고기의 신체를 균질화하고 튜브에 차가운 선별 매체의 300 마이크로리터를 추가로 추가합니다. 35 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 필터링하고, 필터에 티슈 파편만 남아있을 때까지 필요에 따라 추가 선별 매체로 필터를 세척합니다.
그런 다음 분석할 때까지 세포를 얼음 위에 놓습니다. 격리된 세포의 유량 세포 측정 해석을 위해 제조업체의 지침에 따라 유동 세포계 매개변수를 설정합니다. 그리고 림프구 및 전구 세포 게이트를 정의하고 세포 이물질을 배제하기 위한 전방 분산 및 측면 산란 파라미터를 설정하고 셀룰러 이물질을 배제하기 위해 10, 000 ~ 50, 000 이벤트를 획득한다.
세포 두 배를 배제하고 림프구 및/또는 전구체 게이트를 사용하여 GFP 양성 세포의 수와 백분율을 결정합니다. 물리에리트린과 GFP 강도를 사용하면 GFP 음성에 대한 게이트를 GFP 의 낮은 GFP 고세포에 비해 정의합니다. GFP 낮은 및 GFP 높은 세포를 격리하기 위한 문을 어디에 배치할지 배우는 것은 순수한 B 및 T 세포 집단을 얻는 데 중요합니다.
두 개의 별개의 GFP 양성 인구, GFP 낮은 B 세포 및 GFP 높은 T 세포는 흉선으로부터 얻을 수 있다. 3개월 된 제브라피쉬의 신장 골수에 거주하는 B 세포는 GFP의 낮은 수준을 표현한다. GFP 높은 세포는 그러나 부족합니다, T 림프구의 단지 작은 백분율이 나이의 3 달에 골수에 존재한다는 것을 나타내는.
마찬가지로, 비장 샘플은 GFP 높은 세포보다 낮은 GFP의 높은 비율을 보여줍니다. 아직 급성 림프 구성 백혈병을 개발하지 않은 이중 형균 물고기에서, 흉골, 골수 및 비장의 GFP 발현은 단일 형질전환 LCK EGFP 물고기에서 관찰된 것과 유사합니다. 그러나, 기관 당 림프구의 수가 증가.
아마도, 때문에 RAG2 프로모터가 활성화되는 미성숙한 B와 T 세포 인구의 MYC 구동 확장. 6개월에 의하여 형광암을 개발한 B 및 또는 T-ALL을 가진 이중 형질전환 물고기에서 B-ALL은 주로 GFP 저세포를 포함하는 희미하게 형광암입니다. 대조적으로, 밝은 형광 물고기는 GFP 낮은 B-ALL 및 GFP 높은 T-ALL 세포의 고립된 T-ALL 또는 혼합된 인구 둘 다를 수용할 수 있습니다.
실제로, 정량적 중합체 연쇄 반응 분석에 의해 평가된 바와 같이 GFP 저세포는 B 세포 전사체의 상부를 발현한다. 및 GFP 높은 세포는 T 세포 유전자, LCK 및 GFP 마커의 상부를 발현합니다. 현미경으로 B-ALL로 물고기를 인식하는 방법을 배우는 것이 중요합니다.
그리고 GFP 낮은 및 GFP 높은 인구를 분리하기위한 흐름 세포측정 게이트를 적절하게 정의하는 방법. 이 절차에 따라, 당신은 PCR, 시퀀싱, 혈액 또는 생체 내 이식 실험에 대한 GFP 낮은 및 GFP 높은 세포에서 DNA, RNA, 또는 단백질을 분리 할 수 있습니다. LCK GFB 물고기가 T 세포 이외에 형광 B 세포를 가지고 있다는 것을 알게 되면 B와 T-ALL을 평가하기 위해 동일한 동물에서 두 세포 유형을 연구할 수 있었습니다.
