从 lck 中分离恶性和非恶性 b 细胞: egfp斑马鱼

我们最近发现，LCK GFP斑马鱼中的许多B细胞表达低浓度的GP。这使得这条线成为研究B细胞和T细胞的有用工具。这项技术的主要优点是，现在我们可以研究LCK GFP斑马鱼的B细胞和T细胞，或者我们可以研究B-ALL和T-ALL细胞从鱼与癌症。

这些方法支持斑马鱼的B细胞发育和B-ALL研究。与理解适应性免疫系统和小儿癌症中常见的恶性肿瘤有关。如果你从来没有做过这些解剖之前，你可能希望完善你的技术几次，直到你可以获得良好的胸腺和骨髓样本。

视觉演示将帮助观看者识别鱼类中的氟化物和B-ALL细胞，并选择正确的设置来区分B细胞和T细胞的分离。在鱼系统中用0.02%三氯丁二的麻醉后，使用荧光显微镜上的GP过滤器检查两到六个月大的斑马鱼，在分支腔的侧腔内侧检查荧光胸腺。将胸腺放在培养皿中安乐死鱼的位置，并使用荧光显微镜去除GP阳性胸腺。

和明亮的场显微镜设置，以收获肾骨髓和脾脏。将每个收集的器官放在含有500微升冷分拣介质的1.5毫升管中，并使用害虫微管均质器使冰上组织均质化。然后，通过35微米网格过滤器对同质组织进行应变，生成单个细胞悬浮液，将细胞放在冰上。

从两到四个月开始使用荧光显微镜对双转基因抹布进行筛查2:hMYC LCK EGFP鱼，使用低曝光设置来识别明亮的T细胞急性淋巴细胞白血病或T-ALL和高暴露设置，以识别昏暗的B-ALL动物。野生类型控制和白血病前鱼类的GP仅在胸腺中局部。使用简单的三类系统，根据GP荧光的程度对鱼进行分类。

一级鱼显示荧光信号作为胸腺肿瘤，只有有限的局部传播。二级鱼显示胸腺外荧光信号，涉及身体小于50%。三级鱼显示荧光信号超过身体的50%。

把鱼和没有癌症的鱼分开。并且每月监测一次没有GP阳性肿瘤的白血病前鱼，以开发新的 ALL。对于T或B-ALL细胞隔离使用剃刀刀片去除安乐死三级鱼的头部和胸腺区域，并放置身体在培养皿中。

使用P-1000移液器用500微升的冷分拣介质清洗鱼腹腔，在5毫升管中收集细胞和介质。使用新鲜的移液器尖端将2至3个额外的200至300微升微升的冷分拣介质注入体腔，并使用移液器的尖端向鱼体施加温和的压力，将细胞从体腔中挤出到5毫升管中。然后，通过 35 微升网状滤波器对电池悬浮液进行应变。

将细胞放在冰上，直到通过流动细胞学进行分析。对于全身均质，使用害虫微管均质器使鱼体均质化，并在管中额外添加 300 微升的冷分拣介质。通过 35 微米网滤器过滤细胞悬浮液，必要时使用附加分拣介质清洗滤光片，直到过滤器上仅保留组织碎屑。

然后，将细胞放在冰上，直到它们进行分析。对于分离细胞的流动细胞测量分析，根据制造商的指南设置流式细胞仪参数。并获取1万到5万个事件，以设置向前散射和侧散射参数，用于定义淋巴细胞和祖细胞门并排除细胞碎片。

排除细胞双倍，并使用淋巴和/或前体门来确定GP阳性细胞的数量和百分比。使用植物红素和 GFP 强度定义 GFP 负值与 GFP 低对 GFP 高细胞的门。学习将隔离 GFP 低细胞和 GFP 高细胞的大门放置在哪里对于获得纯 B 和 T 细胞群至关重要。

两个不同的GP阳性群体，GFP低B细胞和GP高T细胞可以从胸腺获得。居住在三个月大的斑马鱼肾骨髓中的B细胞表达低浓度的GP。然而，GFP高细胞是稀缺的，表明只有一小部分T淋巴细胞存在于骨髓三个月大。

同样，与GP高细胞的GP低百分比显示高。在尚未发展急性淋巴细胞白血病的双转基因鱼类中，胸腺、骨髓和脾脏中的GFP表达与单转基因LCK EGFP鱼的GFP表达相似。然而，每个器官的淋巴细胞数量增加。

据推测， 由于 Myc 驱动的未成熟 B 和 T 细胞群的扩展， 其中 rag2 启动子是活跃的。在双转基因鱼与B和或T-ALL已经发展了六个月荧光癌B-ALL是昏暗的荧光癌，大多含有GBP低细胞。相比之下，明亮的荧光鱼可以容纳分离的T-ALL或混合种群的GGFP低B-ALL和GGFP高T-ALL细胞。

事实上，根据定量聚合酶链反应分析评估，GFP低细胞表达更高水平的B细胞转录。并且GP高细胞表达更高级别的T细胞基因，LCK和GGFP标记。学习如何通过显微镜识别具有 B-ALL 的鱼至关重要。

以及如何正确定义流式细胞学门，以分离G1P低和GP高种群。按照这个程序，你可以从GP低和GP高细胞分离DNA，RNA或蛋白质PCR，测序，血液或体内移植实验。一旦我们了解到LCK GFB鱼除了T细胞之外还有荧光B细胞，我们就可以研究同一动物的两种细胞类型，以评估B和T-ALL。