이 프로토콜은 핵분열 효모에 있는 성장 결함이 있는 돌연변이에 있는 억제기 돌연변이를 확인하기 위하여 간단하고 효과적인 억제기 스크린을 기술합니다. 전통적인 돌연변이 발생 방법은 세포에서 다중 돌연변이를 생성할 수 있는 독성 화학 물질 또는 UV를 사용합니다. 반대로, 이 프로토콜은 돌연변이 유도 방법을 사용하지 않고 개별 세포에서 단일 억제제 돌연변이를 풍부하게 할 수 있다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변형 구조 및 준비로 이 절차를 시작합니다. 96웰의 폴리스티렌 마이크로플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 액체 매체를 추가합니다. 멸균 어플리케이터를 사용하면 준비된 각 식민지를 소량 으로 가져가액체 매체를 포함하는 개별 우물에서 각 식민지를 중단하십시오.
동일한 미디어의 200 마이크로 리터를 포함하는 플레이트의 모든 행에 대해 빈 우물을 포함합니다. 이제 자동화된 마이크로플레이트 판독기에 연결된 플레이트 판독기 감지 소프트웨어에 프로토콜을 설정합니다. 온도를 섭씨 30도로 설정하고 2분 동안 판독 빈도로 24시간 동안 운동 프로그램을 설정합니다.
이로 인해 우물당 24시간 동안 총 721개의 읽기가 발생합니다. 흔들림을 연속 빠른 궤도 흔들림으로 설정합니다. 광학 판독값을 설정하여 600나노미터의 파장에서 광 산란을 측정하여 광학 밀도를 측정하고 플레이트 아래에서 읽을 빛을 설정합니다.
24시간 후 최종 빈 광학 밀도 판독값을 기록하고 텍스트 프로토콜의 수식을 사용하여 각 샘플을 0.1의 광학 밀도로 희석하는 데 필요한 부피를 결정합니다. 각 실험에서 사용할 희석 볼륨을 일괄 처리하려면 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터를 내보내고 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 함수와 동일한 수식을 삽입합니다. 매 24 시간, 수식을 사용하여 0.1의 광학 밀도에 각 샘플을 희석하기 위해 일 0과 동일한 미디어를 사용합니다.
모든 우물을 0.1의 광학 밀도로 희석하기 위해 수식을 사용해야 합니다. 이것은 그들의 성장 결함에 있는 몇몇 회복을 보여주기 시작했을 지도 모르다 우물을 포함합니다. 매일 생성된 모든 성장 곡선을 저장합니다.
동일한 유전 적 배경을 가진 코호트의 나머지 부분보다 훨씬 높은 최종 광학 밀도 또는 야생 형 식민지와 유사한 성장 곡선에 의해 판단 증가 성장 속도를 보여주는 개별 식민지를 유의하십시오. 이 분석은 일반적으로 약 7~14일 정도 걸립니다. 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다.
플레이트 판독기 분석의 마지막 날부터, 일부 액체 배양은 아마도 부모 돌연변이의 표현형을 완화할 수 있는 억제돌연변이를 확보함으로써 눈에 띄게 회복된 성장속도를 갖는다. 페노전성 회수 된 배양을 저장하려면 액체 배양 250 마이크로 리터를 50 % 글리세롤의 250 마이크로 리터가 함유 된 냉동 튜브에 옮기고 혼합하십시오. 플래시액체 질소에 세포를 동결 하 고 무기한 영하 80도에서 균주를 저장 합니다.
억제제 돌연변이가 유전적으로 유전적 원소인지 확인하려면 표준 유전 교차 방법을 사용하여 좋아하는 돌연변이 S 세포와 좋아하는 돌연변이 P 세포를 교차하십시오. 무료 짝짓기 타입을 가진 2개의 haploid 세포가 혼합되고 질소 기아를 복종할 때, 그(것)들은 4개의 포자의 tetrad를 형성하기 위하여 포자를 포자화하는 zygote를 생성할 수 있습니다. 부모의 유전 물질은 멘델리안 유전학의 규칙에 따라 메이오시스 도중 분리될 것입니다.
포자 후, 동일한 테트라드에서 개별 포자는 해부될 수 있고 접시에 수직으로 관찰된 4개의 개별 식민지를 형성할 수 있다. 마이크로니들을 사용하여 포자를 접시에 하나씩 고르게 놓습니다. 해부 후, 식민지가 나타날 때까지 며칠 동안 섭씨 30도 에서 성장하는 세포를 둡니다.
억제제 돌연변이가 유전적 유전적 원소인 경우, 이 십자가는 두 개의 식민지가 부모 긴장의 질병 표현형을 가지고 있으며 두 개의 식민지가 억제제 균주의 회복 성장속도를 갖는 테트라드를 산출해야 한다. 억제제 표현형과 동일한 유전적 교차체의 부모 표현형을 가진 3개의 식민지를 선택하고 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 게놈 DNA 추출 및 시퀀싱 단계를 진행한다. 그런 다음 텍스트에 자세히 설명된 바와 같이 억제제 돌연변이의 식별을 위한 생물정보학 분석을 수행한다.
개별 식민지의 성장 곡선은 플레이트 리더를 사용하여 연속 모니터링을 통해 초기 시점과 6일 동안 기록되었습니다. 예상대로 야생 형 식민지는 실험 전반에 걸쳐 성장 곡선에 눈에 띄는 변화를 보이지 않습니다. 특히, elf1 삭제 배경과 1 개의 fal1 삭제 식민지를 가진 네 개의 식민지는 느린 성장에서 야생 유형 식민지와 유사한 성장의 일부 다양한 수준으로 성장의 극적인 변화를 보여줍니다.
극적으로, 모든 clr6 돌연변이는 분석의 끝에 의해 더 빠른 속도로 성장하는 일관된 현상 복구를 보여줍니다. 확인된 비대명변화 중 2개는, cue2 돌연변이 및 rpl2702 돌연변이는 현장 지향 돌연변이 발생에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 실험실에서 재구성되었다. Cue2 elf1 이중 돌연변이체 및 rpl2702 elf1 이중 돌연변이체는 무료 elf1 삭제 돌연변이 균주와 교차하였다.
유전 횡단은 확인된 억제제 돌연변이가 elf1 삭제 돌연변이의 느린 성장 표현형을 억제하는 데 성공하고 유전성이 있음을 보여주었습니다. 96웰 플레이트의 일일 희석 기간 동안 인공 성장 회복을 피하기 위해 모든 우물을 동일한 농도로 희석하는 것이 중요합니다. 이 방법은 핵분열 효모 및 기타 미생물에서 잘 특성화되지 않은 수백 개의 유전자의 발견을 가속화하는 높은 처리량 방식으로 억제제 돌연변이를 격리할 수 있게 합니다.
이 방법은 성장 결함을 일으키는 돌연변이가 있고 액체 배양에서 큰 인구로 성장할 수 있는 모든 미생물에 대한 억제제를 격리하는 데 사용될 수 있다. 분열 효모에 있는 억제제 돌연변이를 확인하는 것은 인간에 효모에서 높게 보존된 통로에 관해서 특히 겹치는 통로에 있는 질병을 일으키는 원인이 되는 유전자를 찾아내는 에 있는 잠재적인 연루가 있을 수 있었습니다.
