שלום, שמי ברטולומו בוסקו, ואני דוקטורנט במעבדה לרשת שעתוקים במרכז לביולוגיה אינטגרטיבית של אוניברסיטת טרנטו באיטליה. כפי שאתם יודעים, שעתוק הוא תהליך מורכב ביותר המערב ארגון מרחבי ותת-זמני של גורם שעתוק וגורם קופקטור. רובם, כולל P53 האנושי, מזהים אלמנטים ספציפיים של cis-פעולה, הנקראים אלמנטים של תגובה, והכריכה על ריצוף DNA זה נדרשת לאפנן של שעתוק של גנים היעד.
בעבודה זו, ברצוננו להראות לך את הפרוטוקול ללמוד רצף P53 ספציפי פונקציות transactivation באמצעות שמרים כמערכת מודל כמו חלבון בגן כתב צבע או luciferase או על כימות של צמיחת תאים כדי להדגיש את הצעדים הניסיוניים העיקריים ואת הרבגוניות של גישות אלה. פרוטוקול אחד, בנייה של זני שמרים כתב המכילים אלמנט תגובה P53 ספציפי במעלה הזרם של אדנין-2 או הגן לוציפראז גחלציים. כדי לבנות זן כתב, תחילה בצע את השלבים 1.1 עד 1.15 כדי להפוך תאי שמרים עם אוליגונוקלאוטידים מיקוד אזור האמרגן הרצוי.
הטרנספורמציה מבוססת על הפרוטוקול הסטנדרטי המבוסס על ליתיום אצטט. לאחר טרנספורמנטים מופיעים על לוחות 5-FOA, בדרך כלל לאחר שלושה ימים של דגירה ב 30 מעלות, העתק צלחת אותם על לוחות YPDA לא סלקטיביים וגם על לוחות YPDA המכילים G418, סימון כל צלחת כדי להקל על ההשוואה הבאה שלהם. דגירה הצלחות לילה ב 30 מעלות.
למחרת, לזהות את זני הכתב המועמדים מהמושבות כי הם G418 רגיש אבל גדל על לוחיות YPDA. פס המושבות שזוהו על צלחת YPDA חדשה כדי להשיג מבודד מושבה אחת, ולתת להם לגדול במשך יומיים ב 30 מעלות. בדוק את השילוב הנכון של רכיב התגובה הרצוי P53, ביצוע תגובת PCR עם תנאים שהוזכרו בשלב 1.20.
לטעון aliquot של המוצר PCR על ג'ל אגרוז כדי לבדוק את אורך אמפולייקון הנכון לפני רצף סנגר. פרוטוקול שני, אנו מציגים דוגמה כיצד להעריך את יכולת ההמרה של חלבון P53 באמצעות מים איכותיים מבוססי צבע אדנין-2 שמרים. המר תאי שמרים עם וקטורים של ביטוי P53 בהתאם לאותו פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף הראשון.
פסים מושבות שנאי שמרים יחיד, עד שש לכל צלחת, על צלחת סלקטיבית חדשה, ולתת להם לגדול לילה ב 30 מעלות. יום לאחר מכן, באמצעות קטיפה סטרילית, העתק צלחת פסים על לוחות סלקטיביים חדשים המאפשרים הערכה של פנוטיפ צבע, כלומר לוחות סלקטיביים המכילים כמות מגבילה של אדנין.
דגירה ב30 מעלות במשך שלושה ימים. ניתן לשכפל את אותם פסים מספר פעמים. פרוטוקול 3, אנו מציגים כעת דוגמה להערכת יכולת ההמרה של חלבון P53 באמצעות מוצג שמרי LUC1 המבוסס על אור כמותי.
ראשית, לשנות את תאי שמרים עם וקטורים ביטוי P53 בעקבות, שוב, פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף 2. תדבקו טרנספורמנטים בודדים על צלחות סלקטיביות חדשות המכילות גלוקוז כמקור פחמן, ותנו להם לגדול ב-30 מעלות במהלך הלילה. עבור כל סוג שינוי צורה, צור חמישה עד שבעה תיקונים שונים.
לאחר הצמיחה בן הלילה, יש להשתמש מחדש בכמות קטנה של תאים באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה במדיום סלקטיבי סינתטי המכיל ראפינוז כמקור פחמן. מתלי תאים אלה צריכים להיות בעלי צפיפות אופטית של 600 ננומטר סביב 0.4 ו ניתן לפצל אותם לצלחות מרובות של 96 באר לדגירה בטמפרטורות שונות, טיפולים, או לחשוף תאים לכמות משתנה של גלקטוז כדי להפעיל ביטוי P53. כדי למדוד את פעילות כתב גחלילית, להעביר 10 עד 20 microliters של ההשעיה התא מן הלוח שקוף 96 באר לתוך צלחת לבן 384 באר, ומערבבים את התאים עם נפח שווה של מאגר תזה, דגירה במשך 10, 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.
הוסף 10, 20 מיקרוליטרים של מצע גחלילית לוציפראז. ולמדוד יחידות אור באמצעות קורא לוחות רב-שכבתי. למדוד גם את הצפיפות האופטית של התרבויות בצלחת 96 היטב.
פרוטוקול ארבע, אנו מציגים כעת דוגמה כיצד לנצל את העיכוב של הצמיחה של שמרים המושרה על ידי P53. הפוך תאי שמרים עם וקטורים ביטוי P53, או cotransform אותם עם וקטורים ביטוי כדי לדכא את P53 יחד ואחד מקובקטורים שלה, כגון MDM2, הבא, שוב, פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף אחד. הגדל תאים טרנספורמטיביים במדיום סלקטיבי לצפיפות אופטית אחת בקירוב.
ולדלל אותם ל 0.05, ולהוסיף מולקולה שנבחרה לריכוז המתאים. דגירה תאים ב 30 מעלות על שייקר במשך 42 שעות. לאחר מכן, זרע 100 microliters של תרבות תאי שמרים בצלחות בינוניות סלקטיביות מינימליות.
דגירה במשך יומיים ב30 מעלות. שילוב RE הנכון במקום קלטת ICORE ניתן לבדוק על ידי PCR המושבה, החל מכמות זעירה של תאים מן שיבוטים שמרים מועמדים באמצעות פריימרים המתוארים בטבלה שלוש כדי להגביר את לוקוס ממוקד. מוצרי PCR, להקה של כ 500 נוקלאוטידים, לאחר מכן ניתן לבדוק על ידי רצף סנגר כדי לאשר את הרצף של המיקום הגנומי ערוך לנוכחות של רצף אלמנט התגובה P53 הנכון.
זן הכתב מוכן לשימוש בהסתה תפקודית. כדי להעריך את יכולת ההמרה של חלבון P53, בדוק את הצבע של מושבות שמרים. לדוגמה, אנו מציגים השוואה בין P53 מסוג פראי לבין המוטנטים R175H ו- R282W באמצעות שני כתבים שונים, P21-5-prime ו- PUMA, ושתי טמפרטורות שונות, 30 מעלות ו - 37 מעלות.
מעניין, בעוד R175H הוא אלל P53 אובדן פונקציה, מושבות אדומות בכל התנאים, R282W מראה רגישות לטמפרטורה עם פעילות transactivation שיורית ב 30 מעלות, וכתוצאה מכך מושבות לבנות, אבל אובדן פעילות ב 37 מעלות, וכתוצאה מכך מושבות אדום או ורוד. ערכת נתונים מורחבת מוצגת איור 2 B.Wild-type P53 בארבעה אללים מוטנטים נבדקו לצורך ביצוע עסקאות באמצעות 10 זנים שונים של כתב רכיבי תגובה P53, שלוש טמפרטורות ורמות ביטוי מכוננות. התוצאות מסוכמות בקוד צבע שמזכיר את פנוטיפ הצבע של מושבת השמרים.
אלל המוטנטים P53 K139E שומר על פעילות חלקית והוא רגיש לקור. לדוגמה, מושבות הן אדומות בזן הכתב GADD45 ב 24 ו 30 מעלות, אבל הם לבנים ב 37 מעלות. כאן, אנו מציגים דוגמה של תוצאות שהושגו עם שיטה זו, השוואת מפרט transactivation של שמרים P53 אדם C.elegans.
התוצאות בגרף עמודות מבוטאות כיחידות אור יחסי ממוצעות עם שגיאת תקן של ארבעה שכפולים. חמישה רכיבי תגובה שונים של P53 הושוו. שלוש רמות שונות של ביטוי חלבון P53 נבדקו על ידי שינוי הריכוז של גלקטוז במדיום.
שני אורתולוגי P53 מראים מפרטי טרנסאקטיביות שונים במידה ניכרת. הדבר בא לידי ביטוי בתוצאות עם רכיבי תגובה של ced13 ו- V1 בעלי אותו רצף, למעט נוכחות או היעדרות של רווח נוקלאוטיד 28. האדם P53 מציג ביצועים גבוהים בהרבה עם אתר כריכת V1, בעוד C.elegans P53 מראה את ההפך.
התוצאות אינן תלויות ברמה של ביטוי P53 תחת האמרגן גלקטוז-בלתי ניתן לעיכול. למדוד את צמיחת שמרים על ידי ספירת מספר המושבות שהושגו 100 טיפות תרבות microliters. לחשב את ההשפעה הפעלה מחדש מוטנטים של תרכובות בהתחשב בצמיחה של P53 מסוג פראי להביע שמרים כמו ההשפעה המקסימלית האפשרית, להגדיר 100%בעוד הצמיחה של תאים המבטאים מוטציה P53 מייצגים אפס רמה של הפעלה מחדש.
בדוגמה זו, Nutlin-3a מקל על עיכוב של P53 מסוג פראי שנגרם על ידי דיכוי חוץ של MDM2, בעוד PhiKan083 מחדש חלקית את המוטנט P53 Y220C. בשני המקרים, התוצאה היא הפחתה תלוית P53 של צמיחת שמרים. שמרים תאים בסיסיים הוכיחו שימושי לחקור ערכים, היבטים של פונקציות חלבון P53.
הפרוטוקול המתואר בעבודה זו רגיש במיוחד להערכת פוטנציאל ההשתנות של מוטנט מסוג פראי או סרטן הקשור P53 לגרסאות של אתרי יעד. כמו כן, ניתן להשתמש בגישה כדי לזהות מולקולות קטנות המשפיעות על פונקציות P53 וללמוד אינטראקציה P53 עם קופקטור. השימוש של כתבי צבע, מזעור של luciferase, כמו גם את מבחן עיכוב הצמיחה לגרום בדיקות חסכוניות ומדרגיות פוטנציאל נוח הקרנת הספרייה הכימית.
לבסוף, המערכת המתוארת בעבודה זו ניתן לאמץ בקלות עם המחקר של גורמי שעתוק ספציפיים לרצף אחרים.
