이 방법은 다양한 세포 모형이 어떻게 생성되고 특정 기능을 가진 더 높은 순서 구조로 조직되는지와 같은 생물학에 있는 중요한 질문을 해결하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전사 및 유전체 분석을 위한 Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부에 존재하는 세포의 효율적인 정제를 용이하게 한다는 것입니다. 프로토콜의 주 6의 화요일에, 45 해부 전에 분, 4 섭씨에서 파아항 분말의 하나의 유리병을 검색하고 실온에서 배양.
다음으로, 실온에서 에펜도르프 튜브에 완전한 슈나이더의 매체 또는 CSM을 제쳐 두고 나중에 파통과 파우더에 추가하십시오. 해부 5~10분 전에 주사기를 사용하여 실온 CSM을 캡을 통해 직접 파알 바이알에 밀리리터당 100단위의 농도를 추가합니다. 혼합하려면 먼저 유리병을 뒤집어 캡 내부에 붙어있는 분말을 캡처한 다음 내용물을 위아래로 피펫합니다.
시약을 혼합 한 후, 수조에 비커에 최대 37섭씨까지 물을 가져. 그런 다음 바이알을 30분 동안 비커에 넣고 파통증을 활성화하고 바이알이 떠 있지 않았는지 확인합니다. 파통증이 인큐베이팅되는 동안 냉동실에서 프로테오리틱 효소 블렌드의 알리쿼트를 회수하고 실온에서 배양합니다.
활성화 30 분 후, 실온에서 파아인을 배양. 6주 화요일에는 차가운 CSM의 단계적 동공 뇌를 깨끗한 집게로 해부합니다. 10 분 안에 가능한 한 많은 두뇌를 해부하고 감기 CSM의 신선한 한 방울에 두뇌를 풀.
광학 엽과 중앙 뇌의 접합을 꼬집어 광학 엽을 잘라냅니다. 다음으로, 1x RS의 500 마이크로리터를 포함하는 마이크로튜브의 바닥에 로브를 추가합니다. 실험 조직을 위한 1개의 마이크로튜브 및 음성 대조조직을 위한 1개의 마이크로튜브. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
한 시간 안에 가능한 한 많은 엽을 해부합니다. 마이크로튜브 간 이송 중 조직 손실을 제거하기 위해 해부된 시차 로브를 단일 마이크로튜브에 당기십시오. P200 파이펫을 사용하여 해부된 광학 로브로 마이크로튜브에서 1x RS를 조심스럽게 제거하고 로브를 덮을 충분한 솔루션을 남깁니다.
튜브 측면에 1x RS의 500 마이크로리터를 조심스럽게 추가합니다. 로브가 튜브 의 바닥에 정착한 다음 200 마이크로 리터를 피펫하게하십시오. 믹스를 추방하고, 움직이는 엽을 관찰하고, 로브가 다시 정착할 수 있도록 합니다.
두 샘플의 경우, 활성제의 알리쿼트 600 마이크로리터, 실온 파파인을 마이크로튜브로 한다. 다음으로 해리 솔루션을 만듭니다. 4.2 마이크로리터의 실온 프로테오리틱 효소 블렌드를 600 마이크로리터의 파통과 용액에 첨가하여 밀리리터당 0.18 WU의 최종 농도를 얻고 이를 위아래로 배관하여 용액을 혼합합니다.
그런 다음 각 샘플에서 1x RS를 조심스럽게 제거하고 300 마이크로리터의 해리 용액을 로브에 추가합니다. 샘플을 섭씨 25도에서 배양합니다. 마이크로튜브 ThermoMixer에서 1, 000 RPM 15분 동안.
5분과 10분 의 시간 지점에서 ThermoMixer를 멈추고 로브가 마이크로튜브 의 바닥으로 가라 앉게하십시오. 파이펫 최대 200 마이크로 리터의 용액과 혼합. 15분 잠복 후, 로브가 바닥에 정착할 때까지 기다렸다가 로브를 방해하지 않고 로브에서 해리용액을 조심스럽게 제거하십시오.
1x RS로 로브를 두 번 씻으시다. 조심스럽게 로브를 방해하지 않고 1x RS의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 조심스럽게 200 마이크로 리터를 파이펫하고 부드럽게 용액을 추방합니다. 로브가 바닥으로 가라앉고 반복하도록 허용합니다.
다음으로, 각 샘플을 CSM 500 마이크로리터로 두 번 세척합니다. CSM을 조심스럽게 제거하고 튜브에 CSM의 200 마이크로 리터를 추가하십시오. P200 파이펫을 사용하여 용액이 균일할 때까지 발포하지 않고 위아래로 파이프를 사용하여 조직을 방해합니다.
P200 파이펫을 사용하여 30마이크로미터 메쉬 캡을 통해 세포 서스펜션을 얼음의 5 밀리리터 팩스 튜브로 필터링합니다. 그리고 전체 서스펜션이 통과되는지 확인하십시오. 해리 마이크로튜브를 헹구기 위해 500마이크로리터의 CSM을 추가합니다.
그리고 팩스 튜브에 솔루션을 필터링합니다. 마지막으로, 조심스럽게 팩스 튜브의 캡을 벗습니다. P200을 사용하여 메시 필터 아래에 솔루션을 수집하고 팩스 튜브의 나머지 서스펜션에 추가합니다.
라미나 및 메둘라 신경필에 대한 참고자료로서 DsRed 및 GFP에 특이적인 항체를 가진 면역 염색 엽의 공초점 현미경 검사법은 L3가 광학 엽에서 DsRed 및 GFP 모두에 의해 표지된 유일한 세포 유형임을 확인했습니다. 100, 000 이벤트의 팩트 데이터가 기록되었으며, 그 중 29.9%가 잠재적인 단일 이벤트입니다. 다른 크기의 세포에서 이중으로 세분성과 크기에 따라 문지락이 된 후, 나머지 단일 세포인 L3 뉴런은 배경 세포로부터 잘 분리된 P1의 단단한 클러스터로 나타났다.
이 절차에 이어, RNA-seq 또는 ATAC-seq와 같은 다른 방법은 유전자 발현 또는 크로마티닌 조직의 분석을 통해 생물학적 질문을 해결하기 위해 각각 수행될 수 있다. 이 기술은 상당히 모델로 Drosophila 시각 시스템을 사용하여 복잡한 조직의 개발 그리고 기능의 기초에 유전 기계장치를 탐구하는 연구원의 기능을 발전합니다.
