증폭시 심장 전구 세포 또는 CPC의 분화는 확산에서 커밋된 단계로의 위상 전환이 필요하며,이 프로토콜은 CPC에서 효율적인 내피 계보를 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 기술과 다른 종에 따라 격리된 CC에 적용가능하다는 것입니다. 이 프로토콜은 세포 치료를 위한 CC의 치료 잠재력을 향상시키기 위하여 이용될 수 있습니다.
그것은 또한 분화의 잠재력 그리고 기계장치를 조사하고 이들이 심장 질병에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. CPC는 모양, 크기 및 효능이 다를 수 있는 세포의 불동성 집단입니다. 따라서 사용되는 CPC의 특정 하위 인구에 따라 프로토콜을 조정해야 합니다.
마우스를 마취한 후 70%에탄올로 가슴을 닦으시습니다. 가위를 사용하여 피부와 흉부 벽을 잘라 흉부 구멍을 노출시하십시오. 집게를 사용하여 심장을 들어 올린 다음 가위를 사용하여 베이스에서 잘라냅니다.
차가운 PBS의 다섯 밀리리터를 포함하는 P60 문화 접시에 심장을 전송한 다음, 심장을 펌핑하고 구멍에서 혈액을 배출하는 집게를 사용합니다. 차가운 PBS의 다섯 밀리리터가 들어있는 P60 접시에 심장을 놓고 씻어. 작은 가위를 사용하여 아리아를 제거하고 심장을 두 개의 세로 조각으로 자르고 얼음 차가운 PBS 5 밀리리터로 씻으실 수 있습니다.
작은 가위를 사용하여 심장 조각을 작은 부분으로 자른다. 콜라게나아제 B를 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액한 한 방울을 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 추가하고 멸균 면도날을 사용하여 작은 심장 조각을 완전히 다진다. 다음으로, 접시에 콜라게나아제 B 용액의 2.5 밀리리터를 추가합니다.
37°C의 인큐베이터에 30도 각도로 접시를 놓습니다. 다진 하트 조각을 최대 30분 동안 배양하고 인큐베이션 중에 10분마다 파스퇴르 파이펫을 반복해서 전달합니다. 먼저, 다진 균질화 심장 조각에 2%FBS로 보충된 차가운 HBSS 5밀리리터를 추가합니다.
100 마이크로미터 필터를 사용하여 심장 조각을 필터링하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 원심분리기는 470배 G, 실온에서 5분간. 상체를 버리고 적혈구 용해 버퍼의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
가끔 흔들리면서 5분간 얼음에 배양하세요. 그 후, PBS의 10 밀리리터를 추가하고 40 마이크로미터 필터를 통해 샘플을 필터링하여 잔류 심근세포를 포함한 더 큰 세포를 배제합니다. 원심분리기는 470배 G의 경우, 실온에서는 휴식 없이 5분간.
그런 다음, 10%의 FBS로 보충된 DMEM에서 세포를 다시 일시 중단하여 밀리리터당 100만 개의 세포 농도를 목표로 합니다. 세포를 염색 및 선별을 위해 두 개의 튜브에 분산하여 세포 용액의 1.5 밀리리터를 1개의 튜브에 추가하고 3.5 밀리리터를 두 번째 튜브에 추가합니다. Hoechst 용액을 추가하고 90 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 염료의 동등한 분배를 보장하고 세포의 응고를 방지합니다.
측면 인구는 주요 인구를 제외하고 Hoechst 낮은 왼쪽 모서리에 나타납니다. FACS 플롯에서 베라파밀이 측면 인구가 사라지도록 유도하는 부정적인 제어에 따라 식별될 수 있습니다. 중간 정도의 섭씨 1~37도를 따뜻하게 하고 원심분리기를 섭씨 4도로 식힙니다.
원심 분리는 정렬 튜브를 470 배 G와 섭씨 4도에서 6 분 동안 정렬합니다. 그런 다음, 중간 1에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 중간 크기의 4밀리리터를 포함하는 가스 투과성 P60 접시에 세포를 전송합니다.
세포가 T75 플라스크에서 2~3일 동안 70~80%의 배양 SP-CPC사이에 합류할 때까지 매심을 3일마다 변경하여 각 플라스크에 있는 8밀리리터의 중간 밀리리터를 사용한다. 다음으로, 매체를 조심스럽게 흡인하고 따뜻한 HBSS 의 5 밀리리터로 플라스크를 부드럽게 헹구십시오. 5 밀리리터의 트립신 EDTA로 세포를 섭씨 37도에서 5분간 5%의 이산화탄소로 처리합니다.
그런 다음, 트립신 활성을 중지하기 위해 중간 크기의 5 밀리리터를 추가하고, 15 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 전송한다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 470배 G로 원심분리기. 다음으로, 중간 1개 또는 중간 2개 중 하나에서 세포를 다시 일시 중단한다.
P60 접시에 세포를 접시, 도금 250, 000 SP-CPC 접시 당 다른 혈청 농도를 포함하는 매체의 세 밀리리터. 배양 이틀 후, 죽은 세포를 수집하기 위해 15 밀리리터 튜브로 각 접시에서 배지를 수집합니다. 이전에 설명된 대로 부착 된 세포를 트립시화하고 수집 된 배지를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 수집합니다.
원심분리기는 실온에서 5분 동안 840배 G로, 수퍼나탄을 흡인하고 세포 계수에 대해 중간 1또는 중간 2의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 트라이판 블루로 SP-CPC를 염색하고 실행 가능한 세포와 죽은 세포를 계산합니다. 첫째, 준비된 세포에서 배지를 흡인시키고 따뜻한 HBSS 5밀리리터로 부드럽게 헹구십시오.
세포 인큐베이터에서 5 분 동안 트립신 EDTA의 5 밀리리터로 세포를 치료하십시오. 그런 다음 중간 크기의 밀리리터 5개를 추가하여 트립신 활동을 중지합니다. 셀 서스펜션을 15밀리리터 튜브및 원심분리기로 실온에서 5분 동안 470배 G로 옮긴다.
슈퍼나티를 흡인하고 셀 계수에 대한 중간 2개를 추가합니다. 다음으로, 종자 80, 000 세포는 중간 2의 3 밀리리터를 가진 미리 코팅된 6웰 배양 판의 각 우물로. 플레이트를 섭씨 37도에서 20~24시간 동안 유지한 다음 매음매를 3밀리리터로 변경합니다.
접시를 21일 동안 배양하여 3일마다 배지를 변경합니다. 그 후, 내피 마커로 세포를 염색하고 형광 현미경 검사를 수행하여 분화 된 세포의 내피 성질을 확인합니다. 첫째, 준비된 세포에서 배지를 흡인시키고 따뜻한 HBSS 의 5 밀리리터로 부드럽게 헹구십시오.
세포 인큐베이터에서 5 분 동안 트립신 EDTA의 2 밀리리터로 세포를 치료한 다음 중간 크기의 3 밀리리터를 추가하여 트립신 활동을 중지합니다. 셀 서스펜션을 15밀리리터 튜브및 원심분리기로 실온에서 5분 동안 470배 G로 옮긴다. 수퍼네티를 흡인하고 중간 크기의 밀리리터 1밀리리터를 넣고 부드럽게 섞어 주세요.
세포와 종자를 2, 000 과 4, 000 세포 사이의 세포와 종자를 중간 3의 마이크로리터에서 각각의 매트릭스에 96웰 플레이트의 잘 코팅하였다. 16 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오. 그 후, 세포의 사진을 찍기 위해 두 배율로 밝은 필드 현미경을 사용합니다.
이 연구에서는 심장 전구 세포의 내피 계보 헌신을 용이하게하기 위해 적합한 조건을 탐구합니다. 세포 합류가 60% 이하일 때 3.5%의 FBS로 처리된 샘플에서 유의한 차이가 나타나지 않습니다. 이 합류에 있는 세포가 0.1%FBS로 취급될 때, 그(것)들은 섬유넥틴에 비교될 때 라미닌에 세포 증식에 있는 감소를 보여주지, 그러나 세포 죽음에 있는 아무 증가도 보여주지 않습니다.
대조적으로, 높은 합류에 있는 세포는 두 조건 사이 세포 증식 또는 세포 죽음에서 유의한 다름을 보여주지 않습니다. 세포 모양의 변화는 내피 분화가 성공할 것으로 보이는 적합한 배양 조건의 지표로 보입니다. 내피 분화 배지에서 7~14일 이내에 성공적인 배양은 상이한 형태를 가진 더 큰 세포를 포함하는 것으로 여겨진다.
흥미롭게도, 이 세포는 분화 단계의 끝으로 사라지고 고밀도 배양에서 더 낮은 숫자와 나중에 점에 나타나는 경향이 있었다. 관 형성은 저밀도에서 도금되고 라미닌에 분화되는 세포에서 일관되게 성공하며, 고밀도로 도금된 세포에서 대부분 실패하는 것으로 보입니다. 관 형성은 세포 밀도에 관계없이 fibronectin에 배양된 세포에서 주로 실패하지만, 저밀도에서 분화된 사람들은 때때로 기초적인 관을 형성합니다.
내피 계보를 유도하는 혈청 농도 및 세포 밀도는 매우 중요하며 생존가능성을 유지하면서 증식 속도를 보장하기 위해 조정되어야 합니다. 계보 유도시, 인간 또는 전임상 질병 모델의 CPC는 생체 내 분화 잠재력을 평가하기 위해 세포 이식 연구에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 새로운 심장 재생 도구를 연구하거나 확립하는 데 도움이 될 수 있으며 이전에 초기 혈통 약정의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다.
