유도 만능 줄기 또는 IPS 세포에서 생성된 심근세포는 점점 심장 전기 생리학 분야에서 다양한 생물학적 질문에 대답하기 위해 사용된다. 이 기술의 주요 장점은 심실 특정 프로모터 요소를 사용하여 심근 세포와 같은 심실의 특수 작업 잠재적 기록뿐만 아니라 처리량의 극적인 증가를 허용한다는 것입니다. 렌티바이러스 트랜스듀션을 통해 유전자로 인코딩된 전압 센서의 도입은 인간 유도만능 줄기 세포-유래 심근세포 작용 잠재력을 광학적으로 이미징할 수 있게 해줍니다.
렌즈피바이러스함유 세포배양상과 심근세포 유지보수 배지를 1대 1비율로 혼합하여 시작한다. 감염 효율을 향상시키기 위해 밀리리터 당 8 마이크로 그램의 최종 농도에서 헥사디메헤린 브로마이드를 추가하십시오. 그리고 IPS 세포 유래 심근세포 배양 접시에서 심근세포 유지 배지를 감염 배지로 대체한다.
감염된 심근낭을 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양하고, 감염 배지를 신선한 심근세포 유지 보수 매체로 대체한다. 이미징 전에 세포 배양 배지를 티로드의 용액으로 교환하여 칼슘으로 보충합니다. 그런 다음 심근세포는 화상 스플리터를 장착한 반전된 형광 현미경의 단계에 화상 진찰실에 놓습니다.
전기 적 속도 조정이 필요한 경우 이미징 챔버에 속도 전극을 설치하고 전극을 자극 발생기에 연결합니다. 세포를 초점으로 가져오고, 시야의 중앙에 유전으로 인코딩된 전압 표시기를 표현하는 세포를 찾습니다. 방출된 빛이 영상 스플리터로 라우팅되도록 광학 경로를 설정하고 현미경의 필터 큐브를 이미지 스플리터의 필터와 결합하도록 전환합니다.
카메라를 제어하는 소프트웨어에서 고속 이미징이 가능하도록 획득 설정을 설정하고 제조업체의 지침에 따라 이미지 스플리터를 설정합니다. 두 개의 서로 다른 방출 파장 밴드를 나타내는 두 이미지는 서로 인접해야 하며, 각각 이미지의 절반을 차지합니다. 필요에 따라 카메라에서 생성한 이미지의 초점을 확인하고 조정합니다.
그리고 픽셀 채도를 피할 수 있도록 조명 광의 밝기를 조정합니다. 타임 시리즈의 획득을 설정하고, 측정에 영향을 미치는 길잃은 빛을 피하기 위해 방에 빛을 어둡게. 그런 다음 흥분 라이트 셔터를 열고 이미지 시리즈의 수집을 시작하여 실험적으로 적절하다면 적절한 시점에서 전기 적 속도를 시작합니다.
획득이 완료되면 필요에 따라 여기 라이트 셔터를 닫고 기록을 하드 드라이브에 저장합니다. 그런 다음 기록 설정을 변경하지 않고 셀없이 커버 슬립 영역을 통해 배경을 기록합니다. 광학 멤브레인 전위 기록의 분석을 위해, ImageJ에서 세포를 포함하는 티프 스택을 열고, 자유 손 선택 도구를 사용하여 형광 심근세포에 대한 관심 영역을 그릴 수 있으며, 적색 채널에서는, 영역이 수축하는 동안 영역이 영역밖으로 이동하지 않을 정도로 충분히 크다는 것을 주의한다.
다음으로 분석, 도구, 관심 영역 관리자를 선택하고 T 추가를 선택하여 이 지역을 관심 영역 1로 추가합니다. 관심 영역을 녹색 채널의 동일한 셀 위에 드래그하고 이 영역을 관심 영역 2로 추가합니다. 측정 분석 및 설정 메뉴에서 평균 회색 값을 제외한 모든 옵션을 선택 취소합니다.
관심 영역 관리자에서 더 많은 및 다중 측정값을 클릭하여 슬라이스 옵션당 모든 조각과 행 1개를 측정하고 확인을 클릭합니다. 세 개의 행이 있는 스프레드시트가 포함된 창이 열립니다. 파일 및 저장 As를 사용하여 스프레드시트를 쉼표 분리된 값 파일에 저장합니다. 관심 영역 관리자 창을 닫지 않고 이미지 스택및 스프레드시트 창으로 창을 닫고 백그라운드 측정이 포함된 티프 스택을 엽니다.
관심 영역 관리자에서 더 많은 측정값과 다중 측정값을 클릭하여 슬라이스 옵션당 모든 조각 및 행 1개를 측정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 배경 데이터를 별도의 csv 파일에 저장합니다. 여기서, 대표적인 단일 IPS 세포 유래 심근세포는 RFP 및 GFP 채널에서 이미징 분석 중에 그려진 관심 영역을 표시하는 백색 점선으로 묘사된다. RFP 채널의 신호는 멤브레인 전위의 변화로 인한 강제 또는 공명 에너지 전달증가로 인한 각 작업 전위 동안 형광 강도의 주기적인 증가를 보여줍니다.
GFP 신호는 형광 강도의 주기적인 감소를 나타낸다. RFP/GFP 비율은 동작 잠재력 지속시간 50 및 90 측정과 같은 다운스트림 분석에 사용되는 생물학적 신호입니다. 예를 들어,이 방법을 사용하여 0.5 Hertz에 배치 된 IPS 세포 유래 심근 세포와 같은 30 일 된 심실, 평균 작용 전위 지속 시간 50 의 439 밀리 초, 및 평균 작업 지속 전위 90 의 520 밀리 초.
IPS 세포 유래 심근세포의 전기 자극은 5비트마다 자극률을 증가시키고, 구타율이 증가함에 따라 작용 잠재력의 점진적 단축을 입증하였다. 더욱이, 자발적으로 구타IPS 세포 유래 심근세포의 치료 isoproternol, 비 선택적 베타 아드레노 수용체 작용제, 구타 속도의 신속한 증가로 이어졌다, 그 아고니스트의 증가 용량으로 더 증가 될 수있다. 이 방법은 고전적인 전기 생리학적 측정에 비해 우수한 처리량을 제공하지만 형광 전압 센서의 본질적인 운동 특성에 의해 제한된 시간적 분해능을 포함하여 그 한계를 알고 있어야 합니다.
