يتم استخدام خلايا القلب المتولدة من الخلايا الجذعية أو IPS المستحثة متعددة القدرات بشكل متزايد للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية في مجال الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية. المزايا الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أنها تسمح بزيادة كبيرة في الإنتاجية وكذلك النوع الفرعي تسجيلات محتملة للعمل في البطين مثل myocytes ، وذلك باستخدام عنصر المروج البطينية محددة. إدخال أجهزة استشعار الجهد المشفرة وراثيا من خلال تحويل العدس الفيروسية يسمح التصوير البصري لإمكانات عمل الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان.
تبدأ من خلال خلط خلية تحتوي على فيروس عدس اختلطت مع القلب و القلبية متوسطة الصيانة، بنسبة واحد إلى واحد. يضاف بروميد الهيكساديثيرين بتركيز نهائي يبلغ 8 ميكروغرام لكل ملليلتر، لتعزيز كفاءة العدوى. واستبدال القلبmyocyte المتوسطة الصيانة في طبق ثقافة القلب المشتقة من الخلايا IPS، مع المتوسطة العدوى.
زراعة القلب المصابة لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية، واستبدال وسط العدوى مع القلب الطازجة وسط الصيانة. قبل التصوير، تبادل متوسطة ثقافة الخلية مع حل التيرود، مع مكملة مع الكالسيوم. ثم ضع عضلة القلب في غرفة التصوير على خشبة مسرح مجهر epifluorescence المقلوب المجهزة بمقسم صورة.
إذا كان هناك حاجة إلى سرعة كهربائية، فقم بتركيب أقطاب سرعة في غرفة التصوير وتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد تحفيز. جلب الخلايا في التركيز، وتحديد موقع خلية تعبر عن مؤشر الجهد المشفرة وراثيا في وسط مجال المشاهدة. تعيين المسار البصري بحيث يتم توجيه الضوء المنبعث إلى مقسم الصورة وتبديل مكعب مرشح في المجهر إلى واحد ليتم دمجها مع المرشحات في مقسم الصورة.
في البرنامج الذي يتحكم في الكاميرا، قم بتعيين إعداد الاكتساب بحيث يكون التصوير عالي السرعة ممكنًا، ثم قم بإعداد مقسم الصور وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وينبغي أن تكون الصورتان اللتين تمثلان نطاقين مختلفين من الموجات الموجية للانبعاثات متاخمة لكل منهما، وتشغل كل منهما نصف الصورة. فحص وضبط التركيز من الصورة التي تنتجها الكاميرا حسب الضرورة.
وضبط سطوع ضوء الإضاءة بحيث يتم تجنب تشبع بكسل. تعيين اقتناء سلسلة زمنية، وتميم الضوء في الغرفة لتجنب الضوء الضال التي تؤثر على القياس. ثم فتح مصراع ضوء الإثارة والبدء في الحصول على سلسلة الصور ، بدءا من سرعة الكهربائية في الوقت المناسب ، كما هو مناسب تجريبيا.
عند الانتهاء من عملية الاستحواذ، أغلق مصراع ضوء الإثارة حسب الضرورة واحفظ التسجيل على القرص الصلب. ثم، ترك إعداد التسجيل دون تغيير، تسجيل الخلفية على منطقة من الغطاء بدون خلايا. لتحليل التسجيلات المحتملة للغشاء البصري ، افتح كومة tiff التي تحتوي على الخلايا في ImageJ ، واستخدم أداة الاختيار الحر لرسم منطقة ذات أهمية على عضلة القلب الفلورية ، في القناة الحمراء ، مع الحرص على أن المنطقة كبيرة بما يكفي أن الخلية لن تنتقل من المنطقة أثناء التعاقد.
بعد ذلك، حدد تحليل، أدوات، إدارة منطقة الاهتمام وحدد إضافة T، لإضافة المنطقة كمنطقة ذات فائدة 1. اسحب المنطقة ذات الاهتمام على نفس الخلية في القناة الخضراء، ثم أضف هذه المنطقة كمنطقة الاهتمام 2. ضمن القوائم تحليل و تعيين القياسات، قم بإلغاء تحديد كافة الخيارات باستثناء قيمة متوسط الرمادي.
في إدارة منطقة الاهتمام، انقر فوق أكثر و متعدد قياس لتحديد خيارات قياس كافة الشرائح و صف واحد لكل شريحة ثم انقر فوق موافق. سيتم فتح إطار يحتوي على جدول بيانات يحتوي على الصفوف الثلاثة. استخدم ملف وحفظ باسم لحفظ جدول البيانات في ملف قيمة مفصولة بفاصلة. إغلاق الإطار مع مكدس الصور و إطار جدول البيانات دون إغلاق الإطار إدارة منطقة الاهتمام ثم فتح مكدس tiff يحتوي على قياس الخلفية.
في إدارة منطقة الاهتمام، انقر فوق "قياس أكثر ومتعددة" لتحديد خيارات قياس كافة الشرائح و صف واحد لكل شريحة ثم انقر فوق موافق. ثم احفظ بيانات الخلفية في ملف CSV منفصل. هنا، يتم تصوير القلب القلبي العضلي القلبي المشتق من الخلايا المفردة التي ينبثقها IPS مع الخطوط البيضاء المنقطة التي تشير إلى المناطق ذات الاهتمام، ويتم رسمها أثناء تحليل التصوير في قنوات تقديم العروض والقنوات GFP. توضح الإشارة من قناة RFP زيادة دورية في كثافة الفلورسنت خلال كل عمل محتمل بسبب زيادة نقل الطاقة القسري أو الرنين الناجم عن التغيرات في إمكانات الغشاء.
ومن الناحية التطابقية، تظهر إشارة GFP انخفاضاً دورياً في كثافة الفلورسنت. نسبة عروض تقديم العروض إلى برنامج المنح هو الإشارة البيولوجية المستخدمة في التحليلات النهائية، مثل قياس المدة المحتملة لـ 50 و90. على سبيل المثال، باستخدام هذه الطريقة، البطين القديم 30 يوما مثل خلايا القلب المشتقة من الخلايا IPS وضعت في 0.5 هيرتز، وأظهرت متوسط مدة العمل المحتملة 50 من 439 مللي ثانية، ومتوسط مدة الإجراء المحتملة 90 من 520 مللي ثانية.
التحفيز الكهربائي للقلب الخلايا المشتقة من IPS في زيادة معدلات التحفيز كل خمس ضربات ، أظهر تقصيرًا تدريجيًا لإمكانات العمل مع زيادة معدل الضرب. وعلاوة على ذلك, العلاج من الضرب التلقائي IPS الخلايا المشتقة من القلب مع isoproternol, غير انتقائية بيتا أدرينو مستقبلات ناهض, أدى إلى زيادة فورية في معدل الضرب, التي يمكن زيادة مع زيادة جرعات من ناهض. في حين أن هذه الطريقة توفر إنتاجية متفوقة مقارنة بالقياسات الفسيولوجية الكهربائية الكلاسيكية ، يجب على المرء أن يكون على بينة من حدودها ، بما في ذلك دقة زمنية محدودة من الخصائص الحركية الجوهرية لمستشعر الجهد الفلوري.
