미스터 덴마크 암 협회 (R146-A9394-16-S2)에서 친목에 의해 투자 되었다. MFB와 시가 AUFF 노바 (AUFF-E-2015-FLS-9-8)에 의해 투자 되었다. 미스터와 MFB 공동 대학원, 건강, AU에 의해 투자 되었다. E.F.W. 실험실은 경제 (SAF2015-70857, ERDF-유럽 연합에 의해 공동 투자)와 그랜트 (741888-과학 수사 대-재미) 고급 한 ERC의 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Liliana Fajardo Mellor (유전자, 개발 및 질병; 감사 하겠습니다. 국립 암 연구 센터) 원고의 중요 한 독서에 대 한.

이 프로토콜에는 실험실 쥐에서 수술을 포함 한다. 모든 동물 실험을 개별적으로 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 될 해야 합니다. 동물 복구 및 생존에 접근을 기반으로, 모든 시간에 적절 한 마 취, 통증 관리, 무 균 수술 환경 확인 합니다. 가 열 패드를 사용 하 여 수술 및 마 취에서 회복까지 저체온증을 방지 하기 위해.
1. 시작 시 고려 사항
<ol><li>사용 하는 바이러스에 따라 다른 titer 요구 사항이 적용 될 수 있습니다; 바이러스를 따라 희석. 참고:이 예제에서는 PBS에 희석 한 Adeno 관련 바이러스 titer 1 x 1012 IU/mL에 주입 됩니다. 바이러스 serotype 9 있으며 가이드 RNA Pten 를 유비퀴틴 promotor (그림 1) 아래 Cre 단백질의 표현을 포함 합니다. Pten 의 손실 증가 pAKT 전립선 상피13의 확산.</li>
	<li>수술의 때에 8 주의 나이에 남성 마우스를 사용 하 여 적절 한 전립선 개발 되도록. 참고:이 실험에서 쥐 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쫓 고 마우스 C57BL/6J 배경12 (그림 1)에 있습니다.</li>
	<li>갓 전신 믹스를 준비 하 고 가능 하면 멸 균 유지. 참고: 복구를 위해 더 나은 동물 수술 후, 마 취 해독 제는 좋습니다.<ol>
<li>5 mL 마 취의 전체 볼륨, 혼합 준비 0.15 mL medetomidine 염 산 염 (1mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL), 및 0.25 mL butorphanol (10mg/mL) 4.2 mL와 멸 균 식 염 수 물 한다. 참고: 흡입 가능 isoflurane 등 대체 마 취 방법, 기관 동물 관리 지침에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Medetomidine 염 수술 후의 효과를, 믹스 0.1 mL atipamezole (5 mg/mL) 4.9 mL와 멸 균 식 염 수 물.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 소독과 멸 균으로 무 균 수술 환경을 준비 합니다. 압력솥 사용 하기 전에 수술 악기입니다.</li>
</ol>2. 바이러스-배달 Murine 전립선에
<ol><li>살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½"복 주사 동물을 anesthetize. 0.01 mL/g 몸 무게의 마 취 복용량을 사용 합니다. 절차는 30 분 이상 지속, 유지 마 취 주입 하 여 1/3는 시작 복용량은 매 30 분.</li>
	<li>근육 이완, 페달 철수, 및 종을 반사를 평가 하 여 마 취 깊이 검사 합니다. 반사의 손실, 관찰 하는 경우는 동물의 아랫 면도.</li>
	<li>조심 스럽게 멸 균 면봉을 사용 하 여 각 막 반사의 부족으로 인해 실명을 방지 하기 위해 수의 안과 연 고와 동물의 눈을 커버.</li>
	<li>70% 에탄올과 10 %povidone 요오드 소독 외과 영역을 면도 복 부를 닦아. 주변으로 외과 영역의 중앙에서 외과 영역을 문질러.</li>
	<li>무 균 수술가 위를 사용 하 여 약 1 ㎝의 낮은 복 부 중간에 수직 피부 절 개를 수행 합니다.</li>
	<li>리프트 아래 누워 장기 손상을 방지 하기 위해 좋은 포인트 집게를 사용 하 여 복 막. 신중 하 게 < 8 m m 절 개 통해 복 막 수술가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 참고: 인간, 달리 쥐의 전립선 4 개의 별도 돌출부를 구성. 앞쪽 엽 정액 소포에 첨부 됩니다.</li>
	<li>부드럽게 정액 소포를 밝히기 지방 조직 옆으로 이동 합니다. 조심 스럽게 들어올려 링 집게를 사용 하 여 앞쪽 전립선 될 때까지 정액 소포 식별 (그림 1).</li>
	<li>30G x 8 m m 바늘으로 0.5 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 앞쪽 전립선 상피에서 30 µ L 바이러스 (3 x 1010 바이러스 성 입자) 솔루션의 전체 볼륨을 주입. 누설을 최소화 하 고 액체는 작은 거품을 형성 하는 조직 내에서 흡수 합니다. 복 부 구멍에 다시 정액 소포를 놓습니다.</li>
	<li>2-3 13 m m, 3/8 원와 테이퍼 포인트 바늘 6-0 흡수 봉합을 사용 하 여 간단한 중단된 바늘으로 복을 봉합.</li>
	<li>3 살 균 4.8 x 6.5 m m 클립 복 막의 손상을 방지 하려면 집게와 함께 피부 리프팅 피부를 주식.</li>
	<li>더 나은 복구에 대 한 살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½ "를 사용 하 여 복 주입 하 여 0.01 mL/g 몸 무게의 복용량에서 마 취 해독 제를 적용 합니다. 신중 하 게 그것의 감 금에 있는 동물 뒤 장소.</li>
</ol>3. 수술 후 절차
<ol><li>1 시간에 대 한 난방 패드에 완전히 복구 될 때까지 저체온증을 방지 하기 위해 수술 후 수술 마우스 케이지를 유지. 해독 제를 적용 하는 경우 동물 이어야 한다 깨어 주사 후 몇 분입니다.</li>
	<li>매일 적절 한 상처 치유와 통증 표시에 대 한 동물을 모니터링 합니다. 필요한 경우, 기관 동물 관리 지침에 따라 추가 진통제를 관리 합니다.</li>
	<li>4-5 일 후, 상처를 닫으면 피부 클립을 제거 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 바이러스 주입에 의해 murine 전립선의 앞쪽 엽에 유전자 발현을 변경 하는 방법에 설명 하 고 전립선 암 (그림 2)에 대 한 강력한 새로운 마우스 모델을 만드는 우리. 아 데 노 바이러스의 성공적인 관리 Leow 그 외 여러분 20058에 의해 처음으로 설명. 우리는 이전 어떻게 Cre recombinase 단백질에 대 한 코딩 하는 아 데 노비 루스 조직 관련 ?...

검색 및 전립선 암 치료는 지난 10 년간 크게 개선 됩니다. 아직도, 전립선 암 발생률은 증가, 수명에 따라. 약 1.1 백만 새로운 경우 전세계, 그것 남자 1에 암 관련 된 죽음의 일반적인 원인 중 하나입니다. 전립선 암은 그 개발에서 속도가 느린 하지만 암 고급 전이성 상태로 진행, 예 후 불량-제한 된 치료 옵션. 지금까지 몇 가지 유전자만이 암에 일반적인 드라이버 확인 되었습니다 그리고 그것의 및 multifocality 방해 biomarkers 및 대상 질병 드라이버2,3의 탐지.
클래식 기법의 생성 GEMMs는 종종 그들의 복잡성, 적시 비용, 및 비용에 의해 손상 됩니다. 조건부 녹아웃 모델 배아 치 생식4에서 비활성화 하는 경우에 발생 하는 전립선 암 후보 유전자 연구에 널리 사용 되어 왔습니다. 가장 일반적인 모델 수정된 Probasin5 중 하나에 의해 구동 전립선 특정 Cre recombinase 또는 PSA6 발기인 추가 교차 사육으로는 GEMM에 통합을 포함 한다. 이 모델에서 대부분 전립선 상피 세포의 증식을 생성 하는 동물의 요로 기능7저하 될 수 있습니다 전체 기관에 관심사의 유전자를 대상 것입니다.
Murine 전립선의 앞쪽 엽에 주입 하 여 Cre 단백질의 바이러스 배달만 몇 셀8을 대상으로 하 여이 문제를 해결할 수 있습니다. 고려 실험실 기술 필수 구성 요소, 전문성, 그리고 목표, 방법 혜택 가능한 변이의 광범위 한 범위에서. 아 데 노비 루스 JunB 와 Pten9 또는 Lentivirus Pten 및 Trp5310 타겟팅 타겟팅을 활용 하 여 성공적인 접근 다른 표시 되었습니다. 바이러스 성 구조 나는 GEMM transgenes luciferase, 등을 추가 또한 생물 발광 영상11통해 질병 진행의 비-침략 적 모니터링 활성화 됩니다.
게놈 편집 CRISPR/Cas9 기술을 기반으로 새롭고 빠른 기회를 체세포 녹아웃12의 빠른 생성을 통해 암 연구를 보여준다. 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 바이러스 배달 murine 전립선의 앞쪽 엽 감독 전립선 암의 순수 더 관련 모델을 설정 합니다. 이 방법으로 단일 셀 선택한 돌연변이 나르는 확장 및 침략 수 있는 클론을 형성할 수 있다. 또한, 여러 대상 유전자에 대 한 가이드 RNAs의 사용 다른 유전자에 변경 셀 클론을 생성 합니다. 이 각 유전자 변경 또는 epistatic 메커니즘의 중요성을 계시 할 수 있다 암 진행에 종양이 고 자연 선택의 압력을 허용할 것 이다.
여기 우리는 유전자 발현의 변경 murine 전립선에 바이러스 성 입자를 전달 하는 방법을 제시. 작은 복 부 절 개 하 여 murine 앞쪽 전립선 엽 노출 하 고 바이러스 성 입자는 엽에 주입 됩니다. 5 일 수술 후, 수술 클립은 피부에서 제거 될 수 있습니다 그리고 전립선 암은 8 주 후에서 분석 될 수 있다. 전반적으로, 이것은 마우스를 타협 하지 않고 개발에 더 큰 종양 하는 마우스에 작은 영향을 신속 하 고 비용 효율적인 절차.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh&lt;/sup&gt;/J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td><td>BD</td><td>324825</td><td>for virus injection</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>300013</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>30 G 1/2&#039;&#039; needle</td><td>BD</td><td>304000</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb Suture</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>to close the peritoneum</td></tr><tr><td>Disposable sterilized surgery drape</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Trimming machine</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>to shave the abdomen</td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Needle Holder</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ring Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>to close the skin</td></tr><tr><td>Wound Clip System Remover</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>different models have been used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virus (AAV, AV)</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td>virus used in this protocol is an in-house production</td></tr><tr><td>pAKT antibody</td><td>CST</td><td>4060</td><td>used 1:200 dillution</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>used 1:100 dillution</td></tr></tbody></table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

전립선 암의 증가 발생, 새로운 종양 드라이버 또는 변조기의 식별은 결정적 이다. 전립선 암에 대 한 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 종양이 성분 및 그것의 복잡 한 microevolution 역학에 의해 방해 된다. 전통적인 전립선 암 마우스 모델을 포함, 다른 사람, 사이 생식 및 조건부 녹아웃, oncogenes, 및이 종이 식 모델의 유전자 변형 식. 이러한 모델에 de novo 돌연변이의 발생은, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비용이 많이 드는. 또한, 전통적인 모델의 대부분 인간의 전립선 암 세포의 작은 하위 집합만 있는 고립 된 이벤트로 진화 하는 잘 알려진 반면 전립선 상피의 대다수를 대상. 귀중 한 모델 전립선 암 개시 뿐만 아니라 고급 질병 진행을 시뮬레이션 해야 합니다.
여기는 바이러스 입자에 의해 전립선 상피 세포를 시험 하 여 몇 가지 셀을 대상 하는 방법에 설명 합니다. Murine 전립선에는 설계 된 바이러스의 배달 전립선 epithelia에 유전자 발현의 변경 수 있습니다. 바이러스 유형 및 수량 이로써 암 개시에 대 한 몇 가지 세포 및 유전자 치료에 대 한 많은 셀 시험에 의해 유전자 변경 대상된 셀 수를 정의 합니다. 앞쪽 엽, 비뇨 기 추적에서 원심에서 수술 기반 주사를 통해이 모델에서 종양 동물의 오 줌 기능을 방해 하지 않고 확장할 수 있습니다. 또한, 전립선 상피 세포의 하위 집합만 대상으로 기술, 종양의 클론 확장을 가능 하 게 하 고 따라서 인간의 종양 개시, 진행, 뿐만 아니라 기저 막 통해 침공을 싫어 하지.
이 새로운 기술은 향상 된 생리 적인 관련성 강력한 전립선 암 모델을 제공합니다. 동물의 고통을 제한, 되며 아무 추가 사육 필수 이기 때문에, 전체 동물 수를 줄일 수 있다. 동시에 새로운 후보 유전자 및 통로의 분석 가속, 차례 차례로 더 비용 효율적입니다.

평가 murine 전립선에 바이러스 배달, 샘플 수술 후 3 개월을 분석 했다. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쥐12 셀 Cre 단백질은 바이러스에 의해 표현에 노출에 GFP를 표현 한다. 전립선 샘플 GFP 신호 (그림 2A) 영역을 식별 하는 형광 현미경 검사 법으로 시험 되었다. GFP 신호 전립선 상피만 하지 여부 유전자 편집 유도 하고있다 CRISPR 가이드 Cre 활동을 나?...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.7K 조회수.  Aarhus University. 이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

비디오: Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

연구

유전학

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

발생학

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to assess therapeutic avenues. However, their time-, labor- and cost-intensive nature limits their utility for systematic analysis of gene function. Recent advances in genome-editing technologies overcome those limitations and allow for the rapid generation of specific gene perturbations directly within specific mouse organs in a multiplexed and rapid manner. Here, we describe a CRISPR/Cas9-based method (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to generate thousands of gene knock-out clones within the epithelium of the skin and oral cavity of mice, and provide a protocol detailing the steps necessary to perform a direct&#160;in vivo&#160;CRISPR&#160;screen for tumor suppressor genes. This approach can be applied to other organs or other CRISPR/Cas9 technologies such as CRISPR-activation or CRISPR-inactivation to study the biological function of genes during tissue homeostasis or in various disease settings.

Here we describe a rapid and direct in vivo CRISPR/Cas9 screening methodology using ultrasound-guided in utero embryonic lentiviral injections to simultaneously assess functions of several genes in the skin and oral cavity of immunocompetent mice.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

The CRISPR/Cas9 system offers the potential to make targeted genome editing accessible and affordable to the scientific community. This protocol is intended to demonstrate how to create viruses that will knockout a gene of interest using the CRISPR/Cas9 system, and then inject them stereotaxically into the adult mouse brain.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

신경과학

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

의학

<meta charset="utf8"></head><body>Th17 분화에서 유전자 편집을 위한 가이드 RNA의 레트로바이러스 형질도입

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

면역학 및 감염병학

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

요약

더 많은 비디오 탐색

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달