우리는 망 토-브라질, CNPq-브라질, FAP/DF 재정 지원에 대 한 감사합니다. 우리는 수정 원고에 대 한 박사 휴고 코스타 Paes에 감사입니다.

1. 솔루션 및 미디어
<ol><li>2 X 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), Sabouraud 포도 당 국물, 및 표 1에 의하여 Sabouraud 포도 당 한 천 준비.</li>
</ol>2. 균 Inoculum 성장 조건
<ol><li>필요할 때까지-80 ° C에서 35% 글리세롤에 냉동된 주식으로 모든 곰 팡이 긴장을 저장 합니다.</li>
	<li>각 실험 하기 전에 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>Candida albicans 종자에 대 한:<ol>
<li>재고 유리병을 해 동 하 고 동요 (200 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 문화와 모자 살 균 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 200 µ L를 전송. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 문화의 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>대 한 Cryptococcus neoformans 긴장:<ol>
<li>재고 유리병의 얼어붙은 표면 다쳤어요. 플레이트 Sabouraud 포도 당 한 천 배지 위에 셀 및 48 h 30 ° c.에 대 한 품 어 고립 된 식민지의 성장을 볼 수, 후 최대 15 일 동안 파라핀 필름으로 밀봉 냉장고 (4 ° C)에 번호판을 유지.</li>
			<li>메 마른이 쑤 시 게 또는 살 균 접종 루프를 사용 하 여 접시에서 중간 크기의 고립 된 식민지를 수집 하 고 살 균 50 mL 원뿔 튜브에서 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 접종. 동요 (200 rpm)에서 30 ° C에서 약 24 h에 대 한 품 어.</li>
			<li>24 시간 보육을 초과 하지 마십시오. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오. 그것은 항상 좋은 항균 성 저항에 영향을 미치는 중요 한 요소 이므로 각 테스트 전에 세포의 성장 단계를 표준화. 참고: 두 균 급속 한 전파, 우리의 실험에서 30 ° C에서 성장 했다 하지만 온도 예 임상 치료 (37 ° C) 연구의 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 가장 중요 한 것은,이 초기 보육 시간 미리 각 균 분리 설립 한다 고 재현성을 보장 하기 위해 모든 테스트를 통해 유지.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>곰 팡이 성장 후 실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 원뿔 관 centrifuging 여 세포를 수집 합니다. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 세포와 원심 분리기 다시 resuspend.</li>
	<li>PBS 세척 및 원심 분리 두 번 더 반복 합니다. 3 세척 후 2 X RPMI-1640 매체의 (에 따라 펠 릿 크기) 5 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 (에 따라 세포 현 탁 액의 탁도)에서 1: 100 또는 1:1,000 희석의 1 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>이 희석의 aliquot 10 µ L 그것 hemocytometer 챔버에 놓고 현미경은 4 개의 코너 사분면에 셀의 총 수를 계산 합니다. 농도 계산 하는 수식으로: (총 셀 수/4) x 희석 요인 x 104 (챔버 희석 상수).<ol>
<li>가능성 조사 및 성장 조건을 체계적으로 공부 되 고 격리에 대 한 상관 되었다 있다 100% 생존 능력을 고려 합니다. 참고: 표준화 및 품질 관리의 생존 할 수 효 모10에 대 한 항균 성 자화 율 테스트 (EUCAST) 항진균 최소 억제 농도 (MIC) 방법에 유럽 위원회에 따라에서 다시 도금 .</li>
		<li>성장/생존 상관 관계 연구 분리에 대 한 설립 되지 않았습니다, phloxine B11, trypan 블루 등 죽은 세포를 선택적으로 색상 염료의 도움으로 hemocytometer 라이브 셀을 계산 하 여 곰 팡이 생존 능력을 측정 12, 야누스 그린13또는. 이 프로토콜에 대 한 곰 팡이 세포를 사용 하 여 경우에이 시점에서 인구의 생존 능력은 90% 이상. 참고: 죽은 살아 있는 염료 선택의 균 류와 함께 잘 작동 하지 않을 수 있습니다. 제발 그들을 사용 하기 전에 테스트 합니다. 예를 들어 trypan blue 염료 C. neoformans와 함께 잘 작동 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그 후, 2 X RPMI-1640 중간에 셀 정지 준비 (2 X 조정 inoculum RPMI 1640 매체에서). 96 잘 접시 각 접시 5 mL의 볼륨을 고려 하십시오.<ol>
<li>모든 C. albicans 변종에 대 한 4 x 103 셀/mL의 재고 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 이 농도 각 음 (2 x 103 셀/mL)에서 최종 셀 농도의 2 배입니다.</li>
		<li>C. neoformans 변종에 대 한 셀 2 × 104 셀/mL의 사진 문화를 준비 합니다. 이 농도 각 잘 (1 x 104 셀/mL)에서 최종 셀 농도 두 번.</li>
		<li>다른 버섯에 대 한 어떤 농도 부 화 시간에 관하여 특정 연구에 대 한 이상적인 것 알려진된 항진균 테스트. 곰 팡이의 물질 대사 및 복제 시간 고려해 서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 펩 티 드 (알 수 없는 에이전트)
<ol><li>-20 ° C에서 동결 건조 된 펩 티 드를 저장 하 고 각 실험 전에 이온된 수에 그들을 분해. 최대 저장 시간 한 번 물속에에서 녹아 있는 각 펩 티 드의 성격에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>두 번 분석 결과 (2 배)에 테스트 높은 최종 농도의 aliquots을 준비 합니다. 이상적으로, freeze-thaw 주기를 피하기 위해 사용 하는 한 시간에 대 한 충분 한 펩 티 드와 aliquots의 작은 수를 준비 합니다. 참고: 농도 문학 및 펩 티 드의 속성에 근거 한다. 직렬 희석, 펩 티 드의 약 100 µ M와 함께 시작 하 고 다음 줄이거나 얻은 결과 따라이 농도 범위를 증가 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 참조 Antifungals (긍정적인 컨트롤)
<ol><li>그 물에 희석: 분석의 높은 농도의 2 배 솔루션 준비 (섹션 5 참조: 희석 단계에 대 한 항진균 분석 결과).<ol>
<li>C. albicans 변종에 대 한 fluconazole의 128 µ g/mL 또는 caspofungin의 128 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 모두 접시 농도 64 µ g/mL를 될 것입니다.</li>
		<li>C. neoformans 변종에 대 한 암포 B (수용 성 솔루션)의 32 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 플레이트 농도 16 µ g/mL를 될 것입니다. 참고: 일반적으로 암포 B는 희석 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 이후이 항진균 저조한 물에 용 해. 그러나, 상업적으로 이용 가능한 수용 성 암포 B 준비 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antifungals 유기 용 매에 희석에 대 한: DMSO, 재고 솔루션 X 100을 준비 다음에 사용 하기 위해 물에 10 배 희석. 참고: 이렇게, 잘, DMSO의 최종 농도 초과 하지 않습니다 1%. 곰 팡이 컨트롤은 필요한 일부 버섯 용납 하지 않습니다 잘 솔벤트의이 농도 1 %DMSO 포함 하는 미디어에서 성장할 것입니다 우물. DMSO는 감광, 그래서 호 일 접시 커버 또는 잠복기 동안 어두운 챔버에 배치.</li>
</ol>5. 항진균 분석 결과
참고: 항진균 분석 실험 체 외에 는 국물 microdilution 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침 일부 수정에서 시험에 따라 수행 됩니다.
<ol><li>각 펩 티 드의 두 배 직렬 희석을 준비 하 고 항진균 50 µ L의 최종 볼륨을 96 잘 폴리스 티 렌 microplates에서 제어.<ol>
<li>100 µ L의 최고 2 배 농도에서 항진균/펩 티 드의 원하는 열에 최종 농도 1-3, 시내 행 대답 하는 것을 추가 피 펫을 사용 하 여</li>
		<li>H. B 행에, 다른 우물으로 살 균 물의 50 µ L을 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여,</li>
		<li>최고 농도 (A 행)와 우물의 50 µ L을 제거 하 고 농도 (B 행)의 다음에 전송 균질.</li>
		<li>최저 농도와 잘 때까지 위의 단계를 반복 하 고이 잘 (행 H) 50 µ L를 삭제. 빈 컨트롤 또는 네거티브/성장 제어에 대 한만 물에 두고 열 11 및 12 (행 A, B, C).</li>
		<li>추가할 조정된 inoculum X 2의 50 µ L RPMI 1640 매체에 각 음 (열 1-3 플러스 열 11 (네거티브/성장 제어)); C. albicans 에 대 한 최종 농도 2 x 103 셀/mL, 그리고 최종 농도 C. neoformans 변종 104 셀/mL에 될 것입니다 될 것입니다.</li>
		<li>빈 컨트롤을 준비 (50 µ L 물 + 50 µ L 2 셀 없이 X RPMI-1640 매체) 및 부정/성장 제어 (50 µ L 물 + 항진균 없이 50 µ L 조정 inoculum 2 X RPMI-1640 매체), 그리고 위의 설명 대로 잘 플레이트에 부하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테스트할 각 화합물에 대 한 절차 및 선택한 항진균 제어 (열 4-10)를 반복 합니다. 참고: 직렬 희석 할 수 있습니다 세로로 또는 가로로 (즉, 테스트 하는 주어진된 화합물/추출의 희석 수는 8 개 이상의 경우) 접시에 아래, 실험으로.<ol>
<li>화합물, 참조 하는 경우 약물, 또는 그 구성 요소 중 하나는 감광, 감소 빛에 분석 결과 수행, 호, 플레이트 커버 또는 외피 동안 어두운 챔버에 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 옵션 권장 사항을 고려 하십시오.<ol>
<li>로이 증발 감소 가스 교환을 허용 하는 명확한 커버 플레이트 플레이트를 봉인.</li>
		<li>습 한 챔버;에 접시를 놓으십시오 그것은 또한 증발 줄일 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>C. neoformans를 흔들어 200 rpm으로 24 시간 또는 48 h 모든 C. albicans 긴장, 및 48 h 37 ° C에서 번호판을 품 어. 낮은 최종 볼륨 (100 µ L) 아무 일 좀 발생 하는 것을 보장 합니다. 참고: 24 시간에 마이크 읽기와 C. albicans 긴장에 대 한 48 h 사이 상당한 차이가 관찰 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 48 h 수치는 시각화 하기 쉽습니다.</li>
	<li>형태 또한 오염의 흔적을 확인으로 변경 사항을 확인 하려면 잠복기 전후 반전된 광학 현미경의 도움으로 모든 우물을 관찰 합니다. 참고: 읽기 시각적으로 수행 및 실험의 끝에 촬영 될 수 있습니다. 각 읽기 전에 접시 약간 균질. 600의 OD를 측정 하 여 읽기를 수행할 수 있습니다, 셀 묶습니다 경우 또는 filamentation 하지 관찰 된다.</li>
	<li>별도 날짜에 세 번 이상 실험을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+mechanisms,+epidemiology,+and+consequences+for+treatment.">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li><li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences.">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics.">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AaeAP1+and+AaeAP2:+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion,+Androctonus+aeneas:+structural+characterisation,+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities.">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li><li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts.">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).</li><li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms.">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844 (2016).</li><li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Tests+for+Thick+Walled+Fungal+Spores+(ex:+Oospores+of+Peronospora+manshurica).">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li><li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+stain+for+fungi.">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li><li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis.">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li><li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media.">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li><li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts.">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Microdilution 테스트는 화합물, 화합물의 소량을 사용 하 여 대상의 잠재적인 항진균 성 활동을 분석 하 고 동시에 농도의 범위에서 테스트 수 있습니다. 이 따라,이 프로토콜은 잠재적인 새로운 항진균 성 화합물에 대 한 심사의 첫 번째 단계도 권장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 처음 클리닉, 항진균 치료의 선택에 도움을 설계 되었습니다 M27-A3 프로토콜에 기반은 그리고 새로운 항진균 성 화합?...

곰 팡이 감염 되는 중요 한 의료 우려 최근 수십 년간, 상당히 immunocompromised 개인 등 암 치료 및 HIV/에이즈와 함께 사는 사람들의 숫자에 있는 상승 때문에 주로 증가 하는 데 또는 이식 장기1,2. 그러나, 매우 제한 된 배열 사용 가능한 항진균 약물의과 그들에 게 곰 팡이 저항에 대 한 보고서의 증가 조직의 사상 균 병3의 치료제에 관한 주요 문제에 기여.
새로운 항진균 성 화합물의 항균 성 펩 티 드 (암페어), 작은 양이온 펩 티 드 감염4그들의 타고 난 면역 반응의 일환으로 많은 유기 체에 의해 생산 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 심사 방법 곰 팡이 병원 균에 대 한 이러한 화합물을 테스트 하는 표준화 되지. 다른 절차 때때로 동일한 모델 미생물5,,67에 대 한 앰프의 항진균 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 차이 부족의 일부 프로토콜 세부 화합물 및 저해 재현성 사이 비교를 복잡 하 게.
새로운 약 후보자의 테스트를 표준화 하기 위한 한 가지 방법은 항진균 민감성은 임상 등 임상 설정에서 정의 하는 데 사용 하는 지침 및 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침입니다. 그러나, 이러한 antifungal 감도 테스트 너무 제한적 그리고 받지 않습니다 고려 대사에서 변화에 종에 걸쳐 그들은 단지 몇 가지 선택 에이전트에 대 한 설립 했다. 예를 들어 그들은 할 고려 하지 계정 비 발효 효 모에의 대사 요구.
이 프로토콜 잠재 항진균 성 화합물의 활동의 평가 허용 하 고 항진균 펩 티 드에 대 한 검색에 대 한 여기에 구현 됩니다. 그것은 국물 microdilution 새로운 화합물8,9의 심사를 최적화 하는 수정 CLSI M27-A3 지침에서 시험 기반으로 합니다. 이러한 변경 내용은 컨트롤로 참조 antifungals 사용 하 여 결과 표준화 하는 동안 최적의 사전 테스트 성장 위한 소량의 화합물, 온도 또는 초기 inoculum와 다른 미디어를 사용 하 여 허용 합니다. 다 잘 배양 배지를 사용 하 여이 방법을 신속 하 고 안정적으로 화면 화합물의 많은 수를 가능 하 게.
그것의 고유의 유연성으로 인해이 프로토콜 및 몇 가지 각 색으로 다른 미생물에 대 한 화합물의 다른 화학 클래스와 함께 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino) propane sulfonic acid&lt;em&gt; (MOPS) (o que a gente usa tem um s&amp;oacute;dio, completa o nome dele please)&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use to buffer 2X RPMI medium</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Din&amp;acirc;mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% for (solu&amp;ccedil;&amp;atilde;o de estoque? Criopreserva&amp;ccedil;&amp;atilde;o?)</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td>Para dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o das drogas na dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o seriada</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antifungal drugs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Dish petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Solution Reservoir</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment and other materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugue</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Set to 37&amp;deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Set to 37&amp;deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Cell counting chamber, Neubauer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

곰 팡이 감염 마지막 십 년간에 중요 한 의료 상태 되 있지만 사용 가능한 항진균 약물의 수는 제한. 이 시나리오에서는 새로운 항진균 약물에 대 한 검색이 필요 합니다. 여기 보고 프로토콜 화면 펩 티 드 그들의 항진균 속성에 대 한 방법을 자세히 설명 합니다. 그것은 잠재적인 새로운 antifungals로 항균 성 펩 티 드의 연구에 맞게 수정 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침에서 국물 microdilution 자화 율 시험을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 항진균 성 화합물의 활동을 평가 하는 기능 분석 결과 설명 하 고 조사 분자의 특정 클래스에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 분석 실험 96 잘 접시 작은 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다, 이후 대규모 심사 자동화 환경에서 실시 하는 경우에 특히 시간, 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 표준화 되 고 조정 가능한 임상 프로토콜 곰 팡이 질병의 치료를 개선 하기 위해 새로운 분자의 벤치 작업 추구를 도울 수 있는 방법를 보여 줍니다.

마이크는 완전히 잠복기의 끝에 보이는 곰 팡이 성장을 억제 하는 최저 항균 화합물 농도로 정의 됩니다. 반면 탁도 부정/성장 제어 웰 스에 유사한 어떤 잘 분명 미디어 빈 우물에 유사한 어떤 잘 긍정적인 결과 여겨진다이 프로토콜의 목적은 화면 잠재적인 antifungals 빠른 방법 이므로, 부정적인 것으로 간주. 그러나, 주어진된 앰프 fungistatic 또는 살 진 균 인지 알고에 관?...

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Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.7K 조회수.  University of Brasília. 항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

연구

면역학 및 감염병학

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

생체공학

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental stages. A specified number of spores are spread on an agar plate. This agar plate is incubated for a defined period to allow the fungi to reach the expected developmental stage, except for spores where incubation is not required. Agar plugs covered by spores, hyphae, or mycelium are next withdrawn and transferred onto agar media containing the antifungal compound to be tested either placed at a distance from the fungi or in contact. This method is applicable to test both liquid extracts and solid samples (powders). It is particularly well suited for quantifying the relative contributions of volatile and non-volatile agents in bioactive mixtures and for determining their effects, specifically on spores, early hyphae, and mycelium.
The method is highly relevant for the characterization of the antifungal activity of biocontrol products, notably plant-derived products. Indeed, for plant treatment, the results can be used to guide the choice of mode of application and to establish the trigger thresholds.

We describe a modified agar-based method designed to quantify the antifungal effects of plant-derived products. Both volatile and non-volatile contributions to the antifungal activity can be assessed through this protocol. In addition, efficacy against fungi can be measured at key developmental stages in a single experimental setup.

바이오 제어 제품의 휘발성 및 비휘발성 항진균 활성 측정

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

환경과학

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Dalbavancin에 대한 참조 국물 Microdilution 방법<em&gt; 체외</em호기성 박테리아의 성장&gt; 감수성 테스트

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation on implanted devices or catheters, which is associated with increased virulence and mortality. Biofilms produced by different Candida species exhibit enhanced resistance against various antifungal drugs. Therefore, there is a need to develop effective immunotherapies or adjunctive treatments against Candida biofilms. While the role of cellular immunity is well established in anti-Candida protection, the role of humoral immunity has been studied less.
It has been hypothesized that inhibition of biofilm formation and maturation is one of the major functions of protective antibodies, and Candida albicans germ tube antibodies (CAGTA) have been shown to suppress in vitro growth and biofilm formation of C. albicans earlier. This paper outlines a detailed protocol for evaluating the role of antibodies on biofilms formed by C. tropicalis. The methodology for this protocol involves C. tropicalis biofilm formation in 96-well microtiter plates, which were then incubated in the presence or absence of antigen-specific antibodies, followed by a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) assay for measuring the metabolic activity of fungal cells in the biofilm.
The specificity was confirmed by using appropriate serum controls, including Sap2-specific antibody-depleted serum. The results demonstrate that antibodies present in the serum of immunized animals can inhibit Candida biofilm maturation in vitro. In summary, this paper provides important insights regarding the potential of antibodies in developing novel immunotherapies and synergistic or adjunctive treatments against biofilms during invasive candidiasis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A 96-well microtiter plate-based protocol using a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reduction assay is described herein, to study antibodies' effects on biofilms formed by C. tropicalis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

An In Vitro Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilm

Source: Chandley, P., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/64425">A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an in vitro technique to study the effect of antibodies on fungal biofilms. The pathogenic fungus Candida tropicalis secretes a virulence factor secreted aspartyl proteinase 2 (Sap2), facilitating biofilm formation. Upon introducing a heat-inactivated serum containing Sap2-specific antibodies that inhibit biofilm maturation, the viability of the fungal cells is assessed using a chromogenic assay.

Candida tropicalis Biofilm에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 체외 분석

1. C. tropicalis&#160;biofilm formation

	Prepare&#160;Candida&#160;biofilms in a 96-well flat-bottomed polystyrene microtiter plate as described earlier ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

An In Vitro Broth Microdilution Assay for the Screening of Antifungal Compounds

Source: de-Souza-Silva, C. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57127">Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an in vitro assay to screen antifungal compounds using a broth microdilution assay. Test compounds are serially diluted in a microtiter plate and incubated with a fungal inoculum. Post-incubation, the plate is examined for wells without visible fungal growth to assess the antifungal potential of the test compounds and their minimum inhibitory concentration (MIC).

항진균 화합물 스크리닝을 위한 In vitro Broth Microdilution Assay

1. Solutions and Media

	Prepare 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, phosphate-buffered saline (PBS), Sabouraud dextrose broth, and ...

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

Real-Time Assessment of the Antifungal Activity of Primary Human Immune Cells

Source: Brunel, S. F. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55444">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a>J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates live cell imaging for the analysis of antifungal activity in human neutrophils using fluorescent Aspergillus reporter conidia. Initially, both red and magenta fluorescence are detected within neutrophils, while red fluorescence decreases over time, indicating the degradation of conidia and confirming the antifungal activity of neutrophils.

1차 인간 면역 세포의 항진균 활성에 대한 실시간 평가

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Cellular Immunodiagnostics

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

Source: Zheng, X., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55273">System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

국물 내 마이코박테리아에 대한 테스트 컴파운드의 효과 평가

1. Bacterial Strain and Growth Medium

	Make albumin dextrose and salt stock solution (ADS) by solubilizing 25 g of bovine serum albumin, 10.0 g of ...

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

요약

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