저자 박사 Ming 분 장 및 양 나중 Hsin 쳉 그들의 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품만 사역의 과학 및 기술에 의해 지원 되었다 (대부분-103-2325-B-006-009, 대부분-104-2325-B-006-001, 대부분-105-2325-B-006-001, 및 MOST-106-2320-B-006-068-MY3)의 보건 및 복지 (MOHW106-TDU-B-211-144004). 우리는 또한 그들의 다 광자 공초점 현미경에 대 한 국립 쳉 쿵 대학, 의학 대학의 핵심 연구소에서 지원에 대 한 감사.

모든 실험 쥐에 우리의 연구소 (관리 및 실험 동물의 사용, NCKU 의학 대학에 대 한 가이드)의 지침에 따라 수행 했다.
1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비
<ol><li>시작 하기 전에 실험 프로토콜, 메 마른 외과 봉합, 1 mL 주사기 26 G/0.5 c m 바늘 (대 한 꼬리 정 맥 주사), 얻을 3 mL 주사기 24 G/3 c m 바늘 (대 한 폐 관류), Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM), 트립 신-EDTA 솔루션 (5 g/L 트립 신 및 0.53 m m), 소 태아 혈 청 (FBS), 1 x PBS (137 m NaCl m, 2.7 m m KCl, 10mm 나2포4및 1.8 m m KH2포4), 그리고 6 cm 문화 요리.</li>
</ol>2. 준비 및 서 스 펜 션에 종양 세포의 복구
<ol><li>살 균 Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM) 10% 또는 20% 포함 된 준비 FBS 갓 추가 2mm L-글루타민, 1 x PBS, 0.05% 트립 신-EDTA.</li>
	<li>10% 보충 DMEM 셀 문화 37 ° C에서 FBS 문화 접시에 70-80% 합류 있을 때까지 그들을 성장 하 고.</li>
	<li>뒤에 두 세척 살 균 1 x PBS의 2 mL와 함께 요리에서 문화 미디어 (DMEM)를 제거 합니다.</li>
	<li>0.05%의 1 mL를 추가 모든 세포를 철저 하 게 요리에 트립 신-EDTA. 즉시 솔루션의 800 μ를 제거 하 고 요리에만 200 μ를 떠나. 30에 대 한 37 ° C에서 요리를 품 어 s (셀 유형)에 따라 1 분 및 일시 중단된 상태에서 세포의 대부분은 때까지 기다립니다.</li>
	<li>신선한 DMEM 1 mL을 추가 10% 포함 된 트립 신 하 고 적극적으로 효소 활동을 중지 하는 요리에 직접 FBS 플라스틱 셀 서 스 펜 션 아래로 단일 세포 현 탁 액을 준비 하는 1000 µ L 피 펫과.</li>
	<li>접시에서 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀을 전송 하 고 162 x g 3 분에 실 온에서 셀 아래로 회전.</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 resuspend 종양 세포 1.5 mL 20 %FBS 및 이상 끝 포함 된 DMEM 회전 2 h 37 ° C에서에 셀. 참고: 경우 매체 복구 하는 동안 노란색, 교환 20% 포함 된 신선한 매체와 오래 된 매체 FBS.</li>
</ol>3. 형광 착 색 및 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스테 르 (CFSE)에 종양 세포의 분석
<ol><li>정지에서 세포 복구, 후 Trypan 파랑 Neubauer 챔버 titrating 복용량을 얼룩이 지기 형광 세기에 적절 한 실행 가능한 핸드폰 번호를 계산 하 고 꼬리 정 맥 주입.</li>
	<li>3 분 및 resuspend 수송과 셀의 1 mL에 1 x PBS, 실내 온도 3 분 162 x g에서 원심 분리 뒤 소독에 대 한 실 온에서 162 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>500 µ L 10를 포함 하는 1 X PBS의 수송과 셀 resuspend %FBS 0, 5, 10, 20, 또는 40 µ M CFSE 복용량 적정을 위한 37 oC 어둠 속에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 품 어 고.</li>
	<li>3 분 동안 실 온에서 162 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 1% 포함 된 DMEM의 4 mL와 수송과 셀 resuspend FBS. 이 세척 단계 세 번 더 반복 합니다. 마지막 세척에 대 한 혼자 DMEM의 4 mL와 수송과 셀 resuspend</li>
	<li>꼬리 정 맥 주입 또는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 단일 셀의 형광 강도 계량 분석 CFSE 표시 된 셀을 대상 합니다. 참고: 얼음 FACS 분석 또는 꼬리 정 맥 주사를 수행 하기 전에 셀을 계속.</li>
</ol>4. 폐 식민 분석 결과
<ol><li>20 µ M CFSE와 함께 표시 하는 셀을 준비 (3.4 통해 단계 3.1 참조). 참고: 종양 세포, FACS 분석에서 적정 결과에 따라 라벨 CFSE의 작업 복용량 결정 (단계 3.3 참조).</li>
	<li>4-6 주 꼬리 워밍업-오래 된 남성 C57BL/6 마우스 (6 쥐) 마우스 꼬리 혈관을 팽창 하는 마우스-의해-마우스 기준 5-10 분 위한 할로겐 램프로.</li>
	<li>철저 하 게 혼합 하 고 (5 x 106 셀/mL의 최종 셀 밀도)와 세포 현 탁 액에서 모든 거품을 피하고 1 mL (26Gx1/2) 주사기 CFSE 표시 된 종양 세포를 발음.</li>
	<li>신중 하 게 주사 1 x10 마우스 restrainer에 제기 해야 하는 마우스 꼬리 정 맥으로 DMEM의 200 µ L에서6 CFSE 표시 된 종양 세포. 참고: 동안 주입, 바늘 꼬리 정 맥의 루멘에 직접 배치 됩니다 경우 종양 세포 한다 쉽게 배달 순환으로 주사기에 하드 밀어 필요 없이. 경우를 통해 종양 세포를 밀어, 그들은 있다 가장 가능성이 되었습니다 주입 꼬리 정 맥 이외의 피하 공간으로.</li>
	<li>쥐를 두 그룹으로 CFSE 표시 된 종양 세포를 정 맥으로 받은 분할: 하나의 그룹 confocal 현미경 검사 법 이어서 폐 관류를 받게 될 것 이다 및 ImageJ 정량화 폐 식민 분석 결과 다른 것에서 남아 있을 것입니다 혼자 4-5 장기적인 폐 식민 주 시험.</li>
	<li>20, 38, 또는 45 h와 시간 과정 및 복용량 의존 적정 하는 동안 정 맥으로 주입 하는 1 x 106 종양 세포, anesthetize 50-75 mg/kg zoletil 50, 잘 허용 하 고 적절 한 anesthetizer23와 종양 방위 쥐. 참고: 사용 하 여 수 의사 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 연 고.</li>
	<li>경도 수술가 위로 잘라 피부와 가슴 지역에서 복 부 피하 조직. 수술가 위 및 심 혼 및 폐를 완전히 노출 하는 집게와 흉 막 캐비티를 엽니다. 참고: 혈관을 절단 하지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>뛰어난 베 나 정 맥 (SVC) 및 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 폐 관류 동안 관류 솔루션의 역류를 방지 하기 위해 불 임 수술 봉합을 묶어.</li>
	<li>좌 심 실 벽 균열 (약 2-4 m m) 폐 로부터 관류 솔루션을 배출 하 여 수술가 위로 잘라.</li>
	<li>3 mL 주사기 1 x PBS를 우 심 실에 삽입 하 고 폐는 완전히 창백 하는 붉은 색에서 돌 때까지 폐 관류 동안 지속적인 흡입 물기 솔루션을 제거 합니다.</li>
</ol>5. confocal 현미경 이미징 및 식민지 화 하는 폐 종양 세포의 분석
<ol><li>흉 막 캐비티에서 지금 창백 폐를 제거 하 고 멀리 외과 시저 및 집게24기도 및 결합 조직 인 대를 절단 하 여 5 개의 돌출부를 분리.</li>
	<li>폐 엽의 배치에 대 한 두 개의 막대 사이의 공간을 가진 reticulate 텍스처를 생산 하기 위해 들 것 같은 폐 홀더 같이 그림 3B 에서 나일론 봉합 와인딩 하 여 약 2 개의 금속 막대를 준비 합니다. 6 cm 접시에 폐 소유자를 설정 합니다. 참고: 폐 홀더 confocal 현미경의 대물 렌즈 아래 폐 엽을 안정 시키기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>별장 및 폐 소유자의 reticulate 텍스처에 폐 엽을 수정. 표지 및 1 x PBS와 폐 엽을 축 축 하 게.</li>
	<li>제목 6 cm 문화 접시 폐 엽 폐 식민지 종양 세포를 기록 하는 형광 이미지를 캡처 confocal 현미경 검사 법을 폐 소유자를 은닉.</li>
	<li>이미징, 렌즈를 사용 하 여 (5 X, MPLN, 나: 0.1, WD: 20, 공기).</li>
	<li>NIBA (여기/방출, 470-495 nm/510-550 nm)을 필터 바퀴를 회전 하 고 488 nm 레이저를 사용 하 여 폐 엽에 형광 점의 이미지를 명확 하 게 시각화 CFSE를 자극.</li>
	<li>R690 (MaiTai HP DeepSee 레이저)에 대 한 필터 휠을 회전 2.0 스캔 µs/픽셀 스캔 속도 및 HV, 이득 및 오프셋 최적화 수준.</li>
	<li>10 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지 (512 x 512 픽셀) 캡처 µs/픽셀 스캔 속도.</li>
	<li>계량 하 고 앞에서 설명한21로 ImageJ GraphPad 소프트웨어를 사용 하 여 미세한 이미지를 통계적으로 분석.</li>
</ol>6. 장기 폐 식민 분석 실험
참고: 4.1 4.5 통해 단계를 반복 합니다.
<ol><li>4-5 주 동안 종양 세포 접종 후 쥐를 희생 하 고 1 ~ 2 일 동안 Bouin의 유체25 그들의 폐를 고치십시오.</li>
	<li>계량 하 고 통계 분석 소프트웨어21쥐 폐에서 종양 작은 혹.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

긴 기간 폐 식민 분석 실험, 단기 우리 고용 여기 먼 장기에 폐 식민 CTCs에 의해 vivo에서 평가 하는 방법론 명확 하 게 발표 하 고 식민지에서 CTCs에 조립 하는 polyFN의 특정 역할 분화와 함께 폐에 넘쳐 흐름 및 전이성 프로세스18,19,,2021다음 주도. 비록 장기 셀 추적기 CFSE 3 일전 폐 관류에 대 한 ?...

전이 암 죽음1,2의 주요 원인입니다. 기본 조직에서 파생 하는 종양 세포에에서 순환을 입력 하 고 전에 그들은 다양 한 hematogenous 도전, 예를 들면, anoikis, 면역 공격, 및 혈압 또는 기하학적 구속 조건에서 전단 응력으로 인해 손해 생존 식민지 먼 장기 전이3,4,,56의 성공을 지시 된 중요 한 단계를 수 있습니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 특성화 및 종양 악성 종양, 전이, 암 환자7,8 의 생존 율과 이러한 특성을 상호 활발 한 노력에 현재 되었습니다 따라서, , 9. 암 전이의 과정 vivo에서 이벤트를 구체적으로 묘사, 동물 모델은 유일한 접근 전이10,11,12의 전체 조직의 프로세스를 .
CTCs 먼 장기1,2의 식민지를 포함 하 여 여러 개의 셀룰러 이벤트를 통해 전이성 종양 조직 된다. 그러나, 가장 일반적으로 사용 되 전이 분석 실험13,,1415 먼 장기의 CTC 식민지를 관찰 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 vivo에서 분석 결과 디자인 CTC 식민 시각화에 대 한 긴급 하 게 필요 합니다. 하지만 여러 vivo에서 비보 전 짧은 기간 폐 식민 분석 실험 설계 되었습니다, 문제 및 단점 남아 있습니다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP) 동안-overexpressing 종양 세포에서 사용 된 분석 실험22,23, 안정적 transfect 아래에서 충분 한 GFP 형광 강도 종양 세포를 복제 하는 시간이 걸립니다 현미경입니다. 마찬가지로, 비록 GFP 표현 종양 세포를 대체 하 긴 기간 셀 추적 CFSE와 종양 세포의 얼룩 과도 고용 된 남아 CFSE 표시 된 종양 세포 부착 여부를 판단 하기 어렵거나 단지 내 존재는 삭제 먼 장기16,17의 맥 관 구조.
CTCs의 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직18,,1920,21,22의 마지막 설립에 비판적으로 기여할 발견 되었습니다. . 여기, 우리가 수행 단기 폐 식민 분석 실험 중단된 루이스 폐 암 셀 (LLCs)에서 안정적으로 표현 하는 FN-shRNA (shFN) 또는 출 격-shRNA (shScr) 고 미리 CFSE와 C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 2-3 일 후, 마우스 폐 처음 confocal 현미경 검사 법 및 폐 식민지 LLCs의 정량화를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)를 완전히 복종 되기 전에 맥 관 구조 내에서 연결 되지 않은 CTCs 제거와 함께 끼얹는다 했다. 우리가 명확 하 게 보여주었다 폐 식민지 shFN LLCs의 숫자와 종양 혹 shScr LLCs, 실질적으로 식민과 CTCs에의 성장 촉진에 CTCs에 polyFN 어셈블리의 역할을 확실 한지 알아보는 비해 크게 감소 했다 그는 폐입니다. 우리의 연구 영장 추가 암 전이에서 polyFN의 역할에 대 한 조사.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;(BSA)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Fluid</td><td>MCC(medical chemical corporation)/POISON</td><td>456-A-1GL</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferation Dye</td><td>ebiosciences</td><td>65-0850-85</td><td>Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Media (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-6381-92-6</td><td>For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM )&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Lewis lung carcinoma (LLC)</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, USP&amp;nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>21051-024</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-7447-40-7</td><td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-7778-77-0</td><td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-7647-14-5</td><td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-10039-32-4</td><td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6146</td><td>0.5 g mix with 100 mL 1X PBS</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td>For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )</td></tr><tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac</td><td></td><td>To dilute with 1X PBS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compact Tabletop Centrifuge 2420</td><td>KUBOTA Co.</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Culture dish (6cm)</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable syringe (with needle)</td><td>Perfect Medical Industry Co.</td><td></td><td>24G/3 cm;3 ml &amp;amp; 26G/0.5 cm;1 ml</td></tr><tr><td>End over end mixer</td><td>C.T.I YOUNG CHENN</td><td>TS-20</td><td>For suspended cells recovery&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FACSCalibur (FACS)</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dimeda</td><td>10.102.14</td><td></td></tr><tr><td>Forma Direct Heat CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>HEPA CLASS 100</td><td></td></tr><tr><td>Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm)</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Confocal Microscope BX61WI</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissor</td><td>Dimeda</td><td>08.370.11</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures&amp;nbsp;</td><td>UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO.</td><td>NO. 0034</td><td>Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)</td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td>615001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Greiner tube</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr></tbody></table>

the establishment of a lung colonization assay for circulating tumor cell visualization in lung tissues

전이 암 사망의 주요 원인입니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이, 폐 식민 CTCs에 의해 비판적으로 공헌 한다 폐 전이성 프로세스 초기에 홍보에 역할을 적극적으로 조사 되었습니다. 따라서, 동물 모델은 유일한 접근 전이의 전체 조직의 프로세스를. 우리는 vivo에서 폐 식민 분석 결과 설립 문제가 혈관 넘쳐 흐름 CTCs의 기여를 조사 하기 위한 이전 실험 설계에서 발생, 그 긴 장기 형광 세포 추적 프로그램, carboxyfluorescein 그리고 에스테 르 succinimidyl (CFSE), 일시 중단 된 종양 세포를 사용 폐 관류 폐 제거, confocal 영상 및 정량화 이전 비 특히 갇혀 CTCs를 수행 했다. CTC 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직의 최종 설립에 폐 식민 중재 발견 되었습니다. 여기, 특히 polyFN 어셈블리 CTCs에 폐 식민 넘쳐 흐름의 요구 사항을 테스트, 단기 수행 있는 폐 식민 분석 실험 중단 루이스 폐 암 세포 (LLCs) 안정적으로 FN-shRNA (shFN)를 표현 하거나 출 격-shRNA (shScr)와 20 미리 레이블이 CFSE의 μ M C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 우리는 성공적으로 마우스 폐를 식민지로 shFN LLC는 세포의 능력 shScr LLC 셀에 비해 현저 하 게 점감 되었다 설명 했다. 따라서,이 단기 방법론 특히 식민지 폐 순환 내 CTCs의 능력을 보여 주기 위해 널리 적용할 수 있습니다.

Vivo에서 폐 식민 분석 결과 수행 하기 전에 일시 중단 된 종양 세포에 polyFN 중재 폐 식민지 그리고/또한 전이, 촉진에 넘쳐 흐름 여부를 테스트 하려면 그림 1A 에서 볼 수 있듯이 우리가 먼저 적정 다른 CFSE, 세포 투과성 covalently 세포내 포함 하는 아민 분자26,27 일시 중단 된 종양 세포에 변화 하 고 꽤...

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The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

the-establishment-lung-colonization-assay-for-circulating-tumor-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.2K 조회수.  National Cheng Kung University. 순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

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Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

폐 종양 세포 모집 분석 결과

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

연구

암 연구학

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

의학

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions contribute to tissue architectural changes observed during tumorigenesis remains challenging due to the lack of appropriate models. In this protocol, we describe the generation of a 3D coculture model using a LUSC primary cell culture known as TUM622. TUM622 cells were established from a LUSC patient-derived xenograft (PDX) and have the unique property to form acinar-like structures when seeded in a basement membrane matrix. We demonstrate that TUM622 acini in 3D coculture recapitulate key features of tissue architecture during LUSC progression as well as the dynamic interactions between LUSC cells and components of the tumor microenvironment (TME), including the extracellular matrix (ECM) and cancer-associated fibroblasts (CAFs). We further adapt our principal 3D culturing protocol to demonstrate how this system could be utilized for various downstream analyses. Overall, this organoid model creates a biologically rich and adaptable platform that enables one to gain insight into the cell-intrinsic and extrinsic mechanisms that promote the disruption of epithelial architectures during carcinoma progression and will aid the search for new therapeutic targets and diagnostic markers.

An in vitro model system was developed to capture tissue architectural changes during lung squamous carcinoma (LUSC) progression in a 3-dimensional (3D) co-culture with cancer-associated fibroblasts (CAFs). This organoid system provides a unique platform to investigate the roles of diverse tumor cell-intrinsic and extrinsic changes that modulate the tumor phenotype.

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

CTC Immunofluorescence Assay : A Technique to  Characterize Circulating Tumor Cells

Source: Garcia, J., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59873/semi-automatic-pd-l1-characterization-enumeration-circulating-tumor">Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
This video describes the Circulating Tumor Cells (CTC) Immunofluorescence assay, a technique to characterize the biomarkers on circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patient samples. This assay could be used to monitor dynamic changes of the tumor and immune response, which may reflect the response to chemotherapy, radiation, and possible immunotherapy treatments.

CTC Immunofluorescence Assay : 순환 종양 세포를 특성화하는 기술

Source: Garcia, J., et al. Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Lung Cancer

Ex vivo study

Lung-tumor Tissue Explant Culture: A Procedure to Generate and Culture Precision-cut Lung Tumor Slices

Source: Nagaraj, A. S., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants as a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. This video describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. The protocol describes the methodology to generate and culture precision-cut lung tumor slices for drug response studies.

폐 종양 조직 이식 배양: 정밀하게 절단된 폐 종양 절편을 생성하고 배양하는 절차

Source: Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants as a Prerequisite for Diagnostic Testing.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
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