면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

미세 유체 기술에 기초하여, 정상 혈액 세포로부터 CTC의 격리 및 특성화는 특정 CTC 바이오마커의 사용을 필요로 하지 않으며, 세포 배양과 호환된다. 이 프로토콜은 CTC 추출의 높은 비율을 용이하게하고 악성 세포 학적 특성을 평가하여 CTC의 광범위한 세포 학적 분석을 제공합니다. CTC에 의한 PD-L1 발현은 폐암 관리에 있는 예측 값을 가합니다.

이 시험을 사용하여 그것의 탐지의 개선은 장기적으로 더 나은 참을성 있는 관리를 승진시킬 수 있었습니다. 이 프로토콜의 그밖 응용은 FISH를 사용하여 유전 수차를 검출하거나, CTC에 전사 분석을 실행하고, 어머니에 있는 태아 기원의 세포를 격리하는 것을 포함합니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 줄리 발난디어될 것입니다.

사전 분석 순환 종양 세포 농축의 경우 먼저 7.5 밀리리터의 혈액을 칼륨 EDTA 튜브로 수집하고 세포 침전 및 응고를 피하기 위해 샘플을 부드러운 동요 하에 보관하십시오. 수집 6 시간 이내에 미생물 안전 캐비닛 아래에 서학적 파이펫을 사용하여 전체 혈액의 7.5 밀리리터를 새로운 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 실온에서 1600 회 G에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오. 원심분리의 끝에서, 버피 코트를 방해하지 않고 플라즈마 분획을 수집하고, PBS의 동등한 부피, 최대 7.5 밀리리터로 플라즈마를 희석전송 파이펫을 사용합니다.

다음으로, 혈액 샘플에 적혈구 용해 완충액을 30 밀리리터의 최종 부피에 조심스럽게 추가하고 혈액 수집 튜브를 세 번 부드럽게 반전한 후 튜브를 실온에서 10 분 동안 배치하십시오. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고, 신중하게 상체의 마지막 4 ~ 5 밀리리터를 제외한 모든 제거. 여과된 마이크로파이프를 사용하여 남은 체퍼네티를 제거하고 필터링된 팁이 있는 P1000 마이크로파이프를 사용하여 튜브 벽 아래로 리서스펜션 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.

거품을 도입하지 않으려면 샘플이 균일 할 때까지 셀 펠릿을 부드러운 파이펫팅으로 다시 놓습니다. 펠릿이 다시 중단되면 거품을 도입하지 않고 튜브 벽에 3 밀리리터의 재서스펜션 버퍼를 추가하고 세포를 부드럽게 혼합합니다. 나선형 미세 유체 장치 순환 종양 세포 농축의 경우 먼저 새로운 나선형 미세 유체 칩을 장치에 로드하고 각 입력 및 출력 포트에 빈 50 밀리리터 원심 분리 튜브를 로드합니다.

프라임을 클릭하여 나선형 미세 유체 장치를 3분 동안 프라임합니다. 주기의 끝에 입력 및 출력 튜브를 제거합니다. 재일시 중단된 혈액 샘플을 입력 포트에 적재하고 선명한 15 밀리리터 원판 튜브를 출력 포트에 로드합니다.

그런 다음 달리기를 클릭하고 프로그램 3을 선택하여 31분 순환 종양 세포 농축 프로그램을 시작합니다. 사이클의 끝에서 출력 튜브를 원심분리기로 옮기고, 5밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 상류체의 마지막 2밀리리터를 제외한 모든 것을 제거한다. 그런 다음 마이크로 파이프를 사용하여 마지막 100 마이크로리터를 제외한 모든 수퍼나티를 제거합니다.

면역형광 염색의 경우 혈종계에서 세포를 계산하고, 농축된 시료를 0.2% 결합용 액액 농도의 100 마이크로리터 당 10~5세포로 희석한다. 다음으로, 50마이크로리터의 결합 방지 용액에 담근 면봉을 사용하여 샘플 챔버의 윤곽을 축화하고 샘플 챔버에 폴리리신 유리 슬라이드를 놓습니다. 챔버를 닫고, 피펫을 세 번 위아래로 닫고, 슈퍼네탄트의 마지막 100 마이크로리터에서 샘플을 다시 중단하기 전에 결합 용액으로 마이크로피펫 팁을 코팅한다.

셀 용액을 샘플 챔버로 옮기고 시토스핀을 분당 400회전에서 4분 동안 낮은 가속으로 전용 원심분리기로 샘플을 전달한다. 원심분리가 끝나면 실리콘 이솔레이터를 증착 부위 에 놓고 미생물학적 안전 캐비닛 아래에 2분 동안 미끄럼틀을 건조하게 한 다음 실온에서 10분 동안 4%의 파라포름데히드100마이크로리터로 시토스펀 샘플을 수정한 다음, 2분 동안 PBS의 200마이크로리터로 3분간 세척하였다. 마지막 세척 후, 실온에서 시약을 차단하는 30 분 배양으로 비특이적 결합을 차단한 다음 관심있는 항체 용액의 100 마이크로 리터로 라벨을 부착하십시오.

라벨이 부착된 슬라이드를 100-15 밀리리터 페트리 접시에 멸균물 2밀리리터로 적신 흡수성 종이에 놓고, 밤새 4도에서 불을 보호합니다. 다음 날 아침, PBS로 샘플을 세 번 세척하고 적절한 장착 용액 10 마이크로리터와 유리 커버 슬립으로 샘플을 장착합니다. 그런 다음 뚜껑 슬립을 명확한 매니큐어로 밀봉합니다.

시토스펀 샘플을 이미지화하기 위해 X Y 전동 플랫폼을 사용하여 직선 형광 현미경에 슬라이드를 적재하고 항체 라벨링에 사용되는 형광에 따라 20배 목표 및 적절한 채널을 선택합니다. 수은 램프를 켜고 현미경 및 관련 소프트웨어를 반 자동 촬영에 적용합니다. 램프가 준비되면 수집 메뉴에서 4개의 채널을 정의하고 노출 시간을 설정하고 스캔할 타일을 정의합니다.

타일 및 고급 실험을 클릭하고 스캔할 영역을 정의합니다. 그런 다음 화면의 초점을 조정하고 실험을 시작합니다. 실험이 끝나면 각 채널에 대한 TIF 파일을 내보내고 특히 샘플, 횟수, 염료 및 하위 타일 수를 포함하도록 파일의 이름을 지정합니다.

이미지 분석을 위해 Broad Institute 웹 사이트에서 이미지 분석 소프트웨어를 열고 파일, 파일에서 파이프라인을 클릭하고 4개의 채널 CTC를 분석합니다. 파일을 파일 목록에 넣고 메타데이터를 업데이트하여 파일을 타일별로 그룹화합니다. 그런 다음 이미지를 분석하여 측정 강도 매개 변수에 해당하는 스프레드시트 파일을 엽니다.

최적화된 오염 제거 프로토콜없이, 높은 세균 오염은 24 시간 후에 농축 된 A549 세포주의 조직 배양에서 관찰되어 진핵 세포에서 사망 및 세포 형성학적 변화를 일으킵니다. 대조적으로, 세척 프로토콜 후, 살아있는 A549 세포는 조직 배양 및 중간 제거의 10 시간 후에 2D 배양기에서, 3D 배양 조건 하에서, 및 환자 견본 내의 수득됩니다. 시토스핀을 이용한 폴리리신 코팅 슬라이드에 대한 액체 면역형성 염색 분석또는 면역형광 염색 분석체를 사용하여 두 분석 사이에 열거된 핵의 수에 대한 명확한 구별을 관찰할 수 있다.

사이토스핀 단계없이, 비 사이토스핀 세포 준비에서 흐릿한 윤곽으로 인해 종양 세포로부터 백혈구를 분화하기 어렵다. 여기서 상이한 환자 샘플에서 상이한 대표적인 사실 인정은 백혈구의 잔류 수와 함께 관찰될 수 있고, 특히 전혈 샘플에 강하게 가변적이고 의존하기로 결정된다. 높은 가변성은 또한 얻어진 순환 종양 세포 하위 집단에서 관찰되었다.

사이토스핀의 각 셀은 이미지 분석 소프트웨어에 의해 식별되며, 셀을 추적하고 수동으로 필요에 따라 결과를 확인할 수 있습니다. 실제로 파일럿 분석은 수동 열거형과 이미지 분석 소프트웨어 열거 사이의 일치를 보여 주었습니다. 단백질 항체 혼성화를 위해 사내 설계된 축축한 페트리 접시의 설정은 장치가 전체 잠복기 내내 충분히 축축하게 남아 있기 때문에 매우 중요합니다.