이 작품에서 잭슨 주립 대학 및 미국 부서 방어, 아이디어 상 11-1-0205의 환경 건강을 위한 RCMI 센터를 통해 건강의 국가 학회 (NIMHD-G12MD007581)에 의해 지원 되었다.

참고:이 프로토콜은 McArdle 외 에 설명 11. 시간 표시 막대를 그림 1에 제공 됩니다.
1입니다. 문화 접시의 준비
<ol><li>유리 아래쪽의 hydrophobicity 낮은 15 분 1 mL의 1 M 염 산 (HCl)와 10 m m 유리 바닥을 포함 하는 35 m m 문화 접시 세척.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 모든 HCl을 제거의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.</li>
	<li>70% 에탄올의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.</li>
	<li>셀 특정 문화 매체의 1 mL와 함께 문화 접시 린스 (여기, 사용 α-MEM 10% 열 보충 비활성화 FBS와 1% 비 본질적인 아미노산). 참고: 대우 문화 접시 문화 매체를 포함 하는 다음 날까지 37 ° C에서 가습기와 CO2 인큐베이터에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>35 m m 문화 접시의 잘 처리 유리 하단에 100 %confluency 세포 (MSCs 및 MCF-7 공동 문화)를 성장. 공동 문화 35000 MSC 세포와 24 h MCF7 셀 75000.</li>
</ol>2입니다. 콜라겐 젤의 준비
<ol><li>접촉 시 콜라겐의 중 합을 방지 하기 위해 냉동 실에 콜라겐 젤 pipetting 사용 micropipette 팁을 저장 합니다. 참고: 이것은 가장 중요 한 단계 이다.</li>
	<li>볼륨을 확인 사용 되 나 콜라겐의 농도에 따라 쥐 꼬리 콜라겐의. 이 분석 결과 대 한 콜라겐 젤 100 µ L를 준비 합니다. 참고: 쥐 꼬리 콜라겐 나 재고의 높은 농도 더 작동 합니다. 10 배 따라 콜라겐을 희석 하는 데 사용할 Dulbecco의 수정이 글의 중간의 볼륨을 결정 합니다.</li>
	<li>난 (3.8 µ g/mL 증권), 10 x Dulbecco의 수정 독수리의 매체 및 1 x 세포 배양 매체 2% 태아 둔감 한 혈 청 및 2.4 mg/mL의 콜라겐의 최종 농도에 적절 한 chemoattractant 보충 얼음 쥐 꼬리 콜라겐에 결합.</li>
	<li>나트륨 중 탄산염 해결책 콜라겐 젤 중화의 혼합물 4.5%를 추가 합니다. 참고: 나트륨 중 탄산염 솔루션 추가의 볼륨은 다른 시 약의 정확한 pH에 따라 달라질 수 있습니다. 이 pH 중립 해결책을 보장 하거나 산도 표시기를 사용 하 여 문화 매체에 스트립으로 혼합물을 테스트 하려면 좋습니다.</li>
	<li>바닥에 유리-잘 접시의 바닥 문화 내의 셀 콜라겐 혼합물의 80 µ L.</li>
	<li>37 ° c.에서 가습기와 CO2 배양 기에서 30 분 동안 유해를 콜라겐 젤 허용</li>
	<li>감소 된 혈 청 (2%)와 세포 매체의 2 mL와 함께 콜라겐 젤 커버 하 고 37 ° c 24, 48 또는 72 h에 대 한 가습기와 CO2 인큐베이터에서 세포를 품 어. 주의: 접시는 콜라겐 젤 유리 바닥에서 분리 하지 않도록 주의 처리 되어야 합니다.</li>
</ol>3. 콜라겐의 준비의 예 젤 3.8 µ g /mL의 쥐 꼬리 콜라겐 재고를 사용 하 여
<ol><li>얼음, 쥐 꼬리 콜라겐의 114.5 µ L, DMEM, x 10의 16.6 µ L, 문화 매체를 포함 하는 chemoattractant의 33.1 µ L를 결합 한다.</li>
	<li>나트륨 중 탄산염의 14.0 µ L로 콜라겐 혼합을 무력화.</li>
	<li>2.5 단계에서 계속 합니다.</li>
</ol>4. 셀의 이미징
<ol><li>부드럽게 요리에서 미디어를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 1 mL의 PBS로 젤 린스.</li>
	<li>15 분 동안 4 %paraformaldehyde 1 mL와 함께 셀을 수정 합니다.</li>
	<li>두 번 1 mL의 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>DAPI 솔루션 (100 ng/mL) 실 온에서 20 분에 대 한 셀을 얼룩.</li>
	<li>Confocal 현미경을 사용 하 여 다른 위치에서 400 µ m z-스택 이미지를 16 µ m 단계에서 각 위치의 셀을 이미지. 사용 하는 현미경 confocal 영상 하얀 빛, 아크 여기 소스를 사용 하 여 수 있도록 단위 스캔 디스크가 있다. 0.75의 숫자 조리개와 활용 20 X 렌즈를 사용 합니다.</li>
	<li>이미지 reconstitute<ol>
<li>주어진된 젤 (약 25 이미지)에 대 한 이미지를 열고 이미지 스택 스택 이미지 → 스택 → 이미지를 클릭 하 여 만듭니다. 첫 번째 이미지는 젤 아래쪽에 대응 (z = 0 µ m), 두 번째 이미지는 z 방향에서 첫 번째 단계에 대응 (z = 16 µ m), 세 번째 이미지는 z 방향에서 두 번째 단계에 대응 (z = 32 µ m). 각 이미지 깊이에 각 핵을 평가 하 고 있는 핵 했다 날카로운 초점에 해당 특정 셀에 대 한 침입 깊이 깊이 지정.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric.">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li><li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture:+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function.">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li><li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing,+a+comparison+of+image-based+readout+methods.">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration:+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis.">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li><li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho/ROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis.">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li><li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro.">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198 (2008).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li><li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound.">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li><li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion:+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis.">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li><li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types.">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li><li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Cell+Fusion:+Mechanisms+Slowly+Unravel.">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li><li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+in+microfluidic+systems.">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li><li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+migration+in+three+dimensions.">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li><li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate.">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li></ol>

저자는 경쟁 관심 있는지 선언.

여기, 희귀 및 그들의 microenvironment에 의존 하는 셀을 포함 하 여 세포 유형의 다양 한 편리한 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 3D 침공 분석 결과에서 세포는 그들의 원래 microenvironment에 남아 하 고 콜라겐 젤 포함 하는 chemoattractant에 의해 보호 됩니다. 세포 이동 그리고 콜라겐에 침공. 이 분석 결과에서 셀 스테인드 고 쉽게 젤 내 모니터링 될 수 있습니다. 단순 하 고이 분석 결?...

세포 운동 성 세포의 정상적인 발달 및 생리 적 과정 이다. 그러나, 변화 패턴 및를 침공 하는 세포의 능력에 염증 성 질환 및 암 전이1,2,3를 포함 하 여 병 적인 상태와 연결 됩니다. 전이 암에 가장 저조한 이해 측면. 전이, 암 세포 해야 합니다 여분의 세포 매트릭스 (ECM)을 저하를 현지 조직 및 intravasate를 침략. 혈액 순환, 암 세포는 먼 사이트에 유포 됩니다, 일단 extravasate 하 고 2 차 종양을 형성 한다. 따라서, 능력 저하는 ECM 셀, 마이그레이션, 침략 하 고 관련이 그들의 전이성 잠재력. 다른 방법은 분석 하 고 세포의 이동과 침략 기능 척도 개발 되었습니다. 가장 많이 사용 되는 접근 분석 결과, 시간 경과 현미경 검사 법, 그리고 Boyden 챔버 분석 결과 치유 하는 상처를 포함 한다. 상처 치유 분석 결과4 와 시간 경과 현미경 검사 법은 간단 하 고 편리한 분석 셀 마이그레이션에 예비 통찰력을 줄 것 이라고. 그러나, 둘 다는 세포 생체 내에존재 하는 3D 환경을 반영 하지 않는 2D 분석 실험입니다. 연구 결과 세포 2D 한5,6에 비해 3D 환경에 다르게 반응으로 나타났습니다. 또한, 상처 치유 분석 실험은 재현 하 고 양적 결과7,,89를 어렵습니다. 셀 제외 영역 분석 결과, 분석 결과 치유 하는 상처의 3D 수정 이면 더 순수 관련 분석 결과 이지만 하이브리드 셀 셀 퓨전 이벤트10,11 인 등 수에 낮은 셀에 적합 하지 않습니다. .
Boyden 챔버 분석 결과 세포 연구에 대 한 관련 microenvironments를 제공 하는 3 차원 분석 결과가 이다. 그러나, 그것은 그들의 원래 microenvironment에서 제거 하 고 예금 Boyden 분석 결과 시스템 마이그레이션 및 chemoattractant 포함 매체를 향해 아래쪽으로 침략의 위 상공으로 셀 필요 합니다. 이 3D 접근 취약 그들의 microenvironment 또는 제한 번호10,,1112셀의 마이그레이션 및 침략 기능 분석에 적합 하지 않다. 셀 마이그레이션 및 침략을 분석 하는 새로운 접근은 미세 그라데이션 챔버 시험13. 적합 하 고 마이그레이션 및 침략에 신뢰할 수 있는, 비록이 분석 결과 더 비싼 이며 전형적인 실험실에 대 한 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기 그들의 microenvironment에 민감한 세포를 포함 한 많은 세포 종류와 호환은 숫자에 제한 된 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 후 퍼 그 외 여러분 에 의해 제안 된 프로토콜에서 적응 시켰다 14.이 분석 결과에서 셀 그들의 원래 microenvironment 및 그들의 이동에 남아 있고 chemoattractant11를 포함 하는 콜라겐 젤에서 위쪽으로 이동 침입 모니터링. 이 분석 결과 재현성 및 최적화 되었으며 35 m m 문화 접시에. 그것은 다른 세포 문화 크기, 다른 행렬 또는 접착, 및 다른 chemoattractants의 강도 포함 하 여 다른 시험 조건에 적응 시킬 수 있었다. 이 분석 결과 약 발견 과정에서 초기 심사를 위한 생체 외에서 플랫폼으로 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>mattek glass bottom dishes</td></tr><tr><td>Rat tail collagen I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td>Collagen gel</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>10X Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Confocal Fluorescent microscope</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>Olympus IX81</td><td>Confocal&amp;nbsp; microscope</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA</td><td>40x NA 0.8 objective</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane Inc. Zurich, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris software</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-minimum essential medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; Manassas, VA, USA</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi and Hematti, 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X lens UPLAPO</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>36-064</td><td>Olympus UPLSAPO 20X Objective</td></tr></tbody></table>

moving upwards: a simple and flexible in vitro three-dimensional invasion assay protocol

3D 침입 분석을 개발 하 고, 그들의 microenvironment의 무결성을 영향을 주지 않고 세포를 연구 하는 도전 남아 있다. 전통적인 3D Boyden 챔버 필요한 셀은 원래 문화 위치에서 전치 하 고 새로운 환경에 이동와 같은 분석 실험. 뿐만 아니라이 microenvironment, 내부는 세포질 과정을 방해 하지만 그것은 종종 세포의 손실에 결과. 이러한 문제는 드문, 또는 그들의 microenvironment에 매우 민감한 세포와 거래 할 때 특히 도전. 여기, 우리 둘 다 문제를 방지 하는 3 차원 침공 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 이 분석 결과에서 세포는 잘 작은 내 도금 고는 ECM 매트릭스는 chemoattractant를 포함 하는 셀 위에. 이 없는 셀 변위를 요구 하 고 행렬에 위쪽으로 침략을 셀 수 있습니다. 이 분석 결과에서 셀 침공으로 세포 형태 콜라겐 젤 내 평가 될 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 희귀 하 고 민감한 세포;의 침략 적 용량 특징 유방암 세포 MCF7 고 엽/multipotent 사이의 융합에서 발생 하는 하이브리드 세포 줄기/기질 세포 (MSCs).

우리 유리 아래쪽와 쥐 꼬리 콜라겐 35 m m 문화 접시 사용 개발 하 고 생체 외에서 3D 침공 최적화 나 프로토콜을 분석. 우리는 유 방 암 세포 MCF7 및 MSC 보였다이 분석 결과 사용 하 여 셀 48 h 후 각각 0.04 ± 1.8 µ m 및 41.3 ± 76.0 µ m의 평균 거리에 콜라겐 젤으로 침략 수 때 IGF1 (18.6 ng/mL) chemoattractant (그림 2)로 사용 되었다. 더 중요 한 것은, 우리는 ?...

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Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

moving-upwards-simple-flexible-vitro-three-dimensional-invasion-assay

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

6.0K 조회수.  University of Minnesota - Twin Cities. 이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

연구

의학

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

암 연구학

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

체외에서 FluoroBlok 종양의 침략 분석

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

생물학

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

발생학

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

수정<em&gt; 시험관</em&gt; 침공 분석은 호르몬, 중재 암 세포 침략의 사이토 카인 및 / 또는 성장 인자의 잠재적 인 역할을 확인하는

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

암 생물학의 3D 모델: 헤테로스페로이드의 침입 역학

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

저자 스포트라이트: 두경부암 진행 중 암과 면역 세포 사이의 누화 해독

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

요약

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이 비디오의 챕터

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

체외에서 FluoroBlok 종양의 침략 분석

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

수정

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석