저자는 데이비드 란 게 나 우 수족관 공간; 아낌없이 제공 감사 하 고 싶습니다. 에릭 스톤, 존 C. 무어와 진 탕에 대 한 여기에 사용 된 zebrafish 스트레인 조달에 대 한 레너드 Zon의 연구소에서 zebrafish 유지 보수 및 시 약, 및 앤 로버트 슨와 엘리엇 Hagedorn 도움이. 그들은 또한 옥 타 비오 Hurtado photolithographic 기술에 대 한 조언을 감사 하 고 싶습니다. FE는 어린이 미국 호주 협회 위한 Shriner의 병원에서 동호회에 의해 투자 되었다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 되었다 GM92804를 부여.

애벌레의 microinjection 프로토콜 2011N000127에서 매사 추세 츠 종합 병원 분과 연구 동물 관리에 의해 승인 되었다.
1. 장치 제조
참고: 모든 컴퓨터 보조 그리기 (CAD) 파일 여기에서 설명 하는 사진 평판 마스크를 디자인 하는 데 사용 (그림 1) 다운로드를 위해 사용할 수 있습니다. 링크 테이블의 자료를 참조 하십시오.
<ol><li>표준 photolithographic 기법7를 사용 하 여 클래스 1000 클린 룸에 마스터 형 웨이퍼를 조작. 미세 배열 및 채널에 대 한 제조업체의 지침에 따라 순차적으로 3 별도 마스크를 사용 하 여 3 계층에 에폭시 기반 부정적인 감광 제 패턴: 얕은 기능에 대 한 100 µ m, 중간 기능에 대 한 200 µ m 및 400 µ m에 대 한 깊은 기능. 이미징 장치에 대 한 두 가지 패턴 레이어 얕은 기능과 깊은 기능에 대 한 600 µ m에 대 한 400 µ m를 사용 하 여 경우</li>
	<li>15 cm (그림 2)을 주조에 대 한 페 트리 접시의 기초를 완성 된 웨이퍼를 테이프.</li>
</ol>2. Microstructured 표면 배열-PDMS의 준비
<ol><li>장치를 사용할 수 있도록입니다 (PDMS), 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. 초기자의 5 g PDMS 단위체의 50 g을 결합 하 고 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.</li>
	<li>1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.</li>
	<li>치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.</li>
	<li>메스의 팁과 웨이퍼 표면 사이 접촉을 유지 하는 메스를 사용 하 여 마스터 웨이퍼 장치 주위 잘라 신중 하 게 합니다. 집게를 사용 하 여, 웨이퍼와 깨끗 한 10 cm 배양 접시, 기능 쪽 (그림 3)에 PDMS 복제 껍질.</li>
	<li>산소 플라즈마 35 플라즈마 오븐을 사용 하 여 장치 취급 hydrophobicity를 줄이기 위해 s.</li>
	<li>Zebrafish 태아 매체 (E3) 168 mg/L 에틸 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5)의 포함 된 커버. 전송 피 펫을 사용 하 여 장치의 표면에 물이 흐르는 깊은 기능에서 모든 거품을 제거 합니다.</li>
</ol>3. Microstructured 표면 배열-Agarose의 준비
<ol><li>네거티브 PDMS 몰드를 만들기 위해 먼저 산소 플라즈마와 PDMS 장치 취급.</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 불활성 표면8만들려고 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) 실 란 증기 PDMS 장치 취급. 간단히:
	<ol>
<li>수 처리 기능-사이드 업 연기 후드 내에서 진공 챔버에 PDMS를 놓습니다.</li>
		<li>PDMS, 옆 작은 오픈 유리 또는 알루미늄 접시를 놓고 신중 하 게 PFDTS의 200 µ L 플라스틱 (98 %silane) 접시에. 주의: PFDTS silane 높은 휘발성은, 물으로 강력 하 게 반응, 가연성 이며 접촉에 심각한 피부 및 안구 손상의 원인. 사용 하기 전에 자세히 읽기 MSDS입니다.</li>
		<li>진공 챔버를 닫고 진공 15-30 분, 또는 PFDTS silane 완전히 증발 때까지 적용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장치를 페 트리 접시에 놓고 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 준비 신선한 PDMS 몰드로 사용 합니다.</li>
	<li>적어도 3 h, 65 ° C에서 구워 다음 처리 장치에서 신선한 PDMS의 전체 레이어를 껍질과 신선한 배양 접시에 놓습니다. 이 다음 agarose를 부정적인 형으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Agarose를 준비 하려면 낮은 고 온도 agarose E3에서 전자 레인지에서의 2% 솔루션은 agarose는 완전히 녹아 때까지 끓인 다.</li>
	<li>부정적인 PDMS 몰드에 붓는 뜨거운 agarose 고 흐르는 뜨거운 agarose에 의해 전송 피 펫을 사용 하 여 기능 장치 취재 agarose에서 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>일단 거품이 제거 되는 agarose 설정 하 4 ° C에서 냉동.</li>
	<li>손으로 밑에서 PDMS를 변형 하 여 부정적인 PDMS 몰드에서 agarose 블록을 제거, 새로운 배양 접시, 및 MS-222를 포함 하는 e 3와 젖은 agarose 블록을 전송 합니다.</li>
</ol>4입니다. PDMS 이미징 장치 준비
<ol><li>장치를 사용할 수 있도록, PDMS, 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. PDMS 단위체의 50 g 5 g (동일 단계 2.1에서에서 사용) 초기자 및 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합 결합.</li>
	<li>신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.</li>
	<li>1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.</li>
	<li>치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.</li>
	<li>마스터 웨이퍼에서 소자를 잘라내어 포트 1.5 m m 펀치를 사용 하 여 밖으로 펀치.</li>
	<li>치료 장치 및 6-잘 유리 하단 잘 산소 플라즈마 35 접시 s, 단계 2.6에에서 설명 된 대로.</li>
	<li>10 분 동안 85 ° C 열판에 그것을 배치 하 여 한 장치 기능-사이드-아래 6 잘 플레이트의 각 유리 coverslip에 본드. 참고: 확인 하 고 성공적인 결합, 한쪽 집게를 사용 하 여 보 세 장치 회사 압력을 적용. 장치는 유리 coverslip에 연결 된 유지 되어야 합니다.</li>
</ol>5. 제 브라 문화
<ol><li>표준 기술3를 사용 하 여 2 dpf 문화 zebrafish 태아.</li>
	<li>Dechorionate 배아 포 셉 또는 1 mg/mL 효소를 사용 하 여 그들을 수 있도록 장치에 로드 하기 전에 적어도 30-60 분 (참조 자료 테이블)3 을 혼합.</li>
	<li>배아는 E3 (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) 25 X의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션을 사용 하 여 그들의 페 트리 접시에 anaesthetize</li>
</ol>6. Microstructured 표면-디벗 배열에 Zebrafish의 방향
<ol><li>배아의 쉽게 조작할 수 있는 e 3의 얇은 (1-2 m m) 층에 의해 포함 되는 그것의 페 트리 접시에 2.7 (그림 3A) 단계에서 PDMS 블록을 준비 합니다.</li>
	<li>전송 피 펫을 사용 하 여 PDMS 블록의 표면에 배아 (조건 당 일반적으로 10-20)의 필요한 수를 전송 합니다.</li>
	<li>Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 배아 microstructured divots (그림 3A)에 밀어. Divots의 사용은 지 느 러 미 및 복 부 방향에 특히 적합 합니다. 참고:와 엄격한 divots (지 느 러 미 및 복 부)에 맞게, 배아, 디벗을 병렬로 블록의 표면에 위치 하 고 머리 루프를 사용 하 여 위치에 그들을 압 연. 깊이 디벗으로 그들을 밀어 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>7. Microstructured 표면-에서 Zebrafish의 방향을 Microstructured 채널
<ol><li>E3 PDMS 블록 microstructured 채널 (그림 3B) e 3의 수준, 블록의 가장자리 아래로 떨어지면 하지만 여전히 존재 저수지와 채널에는 PDMS에 얇은 층에서 때까지 전송 피 펫을 사용 하 여 패턴을 그립니다.</li>
	<li>가장자리를 오버플로 하지 않도록 주의 되 고 전송 피 펫을 사용 하 여 저수지에 단계의 5.3 10 배아를 전송.</li>
	<li>머리 루프를 사용 하 여 적절 한 채널의 입구에 깔때기에 각 배아를 조작 하 고 태아의 머리는 채널 쪽으로 고 태아는 적절 한 방향으로 채널 입력 되도록 방향.</li>
	<li>각 태아 orienting microfeatures 장소에 그것을 유지 하는 데 도움이 채널 벽에 도달할 때까지 머리 루프를 사용 하 여 채널 아래로 슬라이드. Microstructured 채널의 사용은 특히 측면 방향에 대 한 권장 됩니다. 참고: microinjection 중 슬라이딩 배아를 줄이기 위해, 저수지에서 e 3를 그려서 표면 장력의 양을 조정 해보십시오.</li>
</ol>8입니다. 제 브라 microinjection
<ol><li>
Microinjection 바늘을 준비 합니다.
	<ol>
<li>앞에서 설명한4micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 붕 규 산 유리 microcapillary 바늘을 확인 합니다. 결과 바늘 약 10 m m의 테이퍼 길이 한쪽 끝 지점으로 테이퍼 합니다.</li>
		<li>이 경우 100 nM chemoattractant에 주입 하는 솔루션을 준비 (N-Formylmethionine-leucyl-페닐알라닌 (fMLP) 또는 Leukotriene b 4 (LTB4))와 100 nM 70 kDa Rhodamine dextran 추적 프로그램 PBS에.</li>
		<li>가늘게 가늘게 한 피 펫을 사용 하 여 바늘에 솔루션의 5 µ L 로드 팁 (자료 표 참조).</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 장착 하 고 picopump microinjector에 연결 된 micromanipulator에 바늘을 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>집게와 테이퍼 팁을 곤란 하 게 하 여 45 ° 각도로 바늘의 팁을 휴식.</li>
	<li>1 주입 bolus 크기 조정 picopump 컨트롤러에 주입 시간을 조정 하 여 nL.</li>
	<li>Microinjection 바늘의 각도 조정 합니다. Micromanipulation 컨트롤러에 45 °의 바늘 각도 일반적으로 태아의 길이에 평행 하 게 바늘으로 좋은 출발점. 험한 각도 microinjection 동안 태아의 측면 움직임을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>왼손으로 페 트리 접시와 오른쪽으로 바늘 micromanipulator controlling, microinjection,이 경우 otic 소포의 의도 사이트로 최대한 바늘 가까이 가져. 참고: otic 소포 직사각형 기관 후부 두 작은 뚜렷한 어두운 직사각형 구조 (otoliths)를 포함 하는 눈으로 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulation 컨트롤러를 사용 하는 바늘의 팁, 소포 내 (이 경우 otic 소포)에 대상 조직을 관통 하 고 picopump 발 스위치를 사용 하 여 미리 설정 된 볼륨을 주입. 참고: 조직 침투를 저항 하는 경우 부드럽게 micromanipulation 컨트롤러 노브 도청 보십시오.</li>
	<li>배아를 출시, E3 표면 위쪽에서 전송 피 펫을 사용 하 여 아래쪽 또는 배아 주변 E3에 출시 되는 접시를 소용돌이 흐름.</li>
	<li>MS-222 전송 피 펫을 사용 하 여 없이 e 3의 복구 접시에 배아를 전송.</li>
</ol>9. 장치 이미징 PDMS를 사용 하 여 배아의 심사
<ol><li>포트를 통해 흐르는 E3 (+ MS-222) 단계의 4.7 장치 프라임. 이 행 해질 수 있다 1000 µ L 피 펫 또는 좁은 팁 전송 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>채워 잘 e 3 + MS-222 장치 덮여 때까지.</li>
	<li>잘 사용 하 여 각 전송 피 펫에 8.7 단계에서 4 삽입 된 배아를 제공 합니다. E3 + MS-222 (5.3 단계)를 로드 하기 전에 1-2 분 동안 배양 하 여 배아 미리 마 취 될 수 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 동양 (꼬리 1 또는 머리-첫 번째, 사용 하는 장치에 따라), 원하는 방향으로 영상 채널의 입구에서 배아 및 장치 (그림 4A)에 부분적으로 그들을 밀어. 이 장치에 균등 하 게 그들을 그릴 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>배아 채널 (그림 4B) 이미징에 대 한 올바른 방향으로 그려집니다 때까지 1000 µ L 피 펫 또는 전송 피 펫을 사용 하 여 포트에서 장치를 통해 E3를 그립니다. 참고: 트래핑 지점 과거 배아를 빨 아 하지 않도록 주의 하십시오,이 배아를 손상 하 고 그들의 방향을 변경 합니다.</li>
	<li>(그림 4C) 이미징을 위한 현미경을 잘 플레이트를 전송 합니다.</li>
	<li>
이미지를 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여입니다.
	<ol>
<li>적절 한 렌즈를 선택 하 여 확대를 조정 합니다. 10 배는 일반적으로 이미징 zebrafish 호 중구 마이그레이션에 대 한 유용한 확대.</li>
		<li>각 신호는 분명, 하지만 하지 포화 되도록 광원 강도 및 각 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.</li>
		<li>각 채널에 대 한 이미지를 캡처하십시오. 여기, 우리가 사용 하는 녹색 형광 단백질 (GFP, 예: 470/22, Em: 525/50), 텍사스 레드 (TxRed, 예: 585/29, Em: 628/32) 채널을 전송. 멀티 채널 이미지 후 처리 하는 동안 결합 될 수 있다 (그림 4B-I).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

여기, 우리는 사용 설명 장치 우리는 최근 2 dpf zebrafish microinjection의5, 촉진 하기 위하여 소개 하는 배아의 편리한 이미징에 대 한 간단한 agarose 무료 장착 장치 개발. 이러한 도구는 zebrafish 기법에 대 한 유용한 장치 제조를 위한 photolithographic 기술의 유틸리티를 강조 표시합니다.
우리는 발견 MSA 장치 특히 유용 세포 또는 입자의 주입을 위해 microinjection 바늘 ?...

Zebrafish의 기본적인 발달 생물학 대규모 유전 연구에서 다양 한 분야에 대 한 강력한 모델로 등장 하 고 화학 스크린1,2. 일상적인 유전자 조작, 유전자 overexpression, 최저, CRISPR/Cas9 mutagenesis, transgenesis 등 상업적으로 간단한, 쉬운--사용의 개발을 주도하 고 있다 단일 셀 zygote에 유전 물질의 microinjection에 의존 방향을 사출3계란 안정화를 사용할 수 있는 도구. 감염, 이식 등 다른 접근으로 나중 단계 태아 그리고 애벌레 더 큰 게이지 모 세관 바늘4를 사용 하 여 microinjection을 해야 하는 경우가 많습니다. 그러나, 더 큰 계기 바늘의 사용으로 밀거나 태아 롤링 없이 표적 조직에 침투 하기 어려운 중요 한 기술적 과제, 선물. 이러한 조건에서 절차 동안 건조를 방지 하는 것은 어렵다, 하는 동안 태아를 안정화 하는 데 필요한 적절 한 물 긴장 및 배아 수 있습니다 이상적으로 표적 조직에 주입에 대 한 지향.
Microinjection, 다음 그것이 주입된 태아 성공적으로 주입 되어, 그를 선택 하 고 초기 시간 포인트의 이미지를 캡처 화면 종종 유용 합니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 microinjection5, 그리고 빠른 이미지 기반 심사 후 주입을 위한 다양 한 방향에서 2 dpf 배아를 안정화 하는 데 도움이 microstructured 장치의 범위를 개발 했습니다.
이 장치에 충분 한 구조 해상도 얻으려면, 우리는 photolithographic 기술을 활용. 최근 미세 제작 추정 마이크로 전자 산업 등에서 일반적으로 사용 되는, 이러한 접근 1-1000 µ m, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 조작에 적합 한 규모에서에서 배열 하는 수직 구조를 얻을 수 있습니다. 모든 장치입니다 (PDMS), 저렴 한, 생물학으로 비활성, 육체적으로 강력 하 고 투명 한은 사용 하 여 날조 되었다.
Microstructured 표면 배열 (MSAs) 꽃무늬 최고 표면 PDMS의 블록으로 포맷 했다, 계란 microinjection 위해 간단한 채널 agarose 블록에 유사한 일반적으로 사용. 포스트 주입 심사에 대 한 이미징 장치 6 표준 유리 바닥 6 잘 플레이트에 배열할 수 있다. 이 소자는 배아의 쉬운 로딩을 위한, 언로드 절차 편리 하 게 이미지 기반 구조 촉진 특정 배아의 수에 의해 개발 된 이전 그 장치 보다 더 많은 사용자 친화적인 방식으로 접근을 차단 합니다 비비 실험실6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafish 대규모 유전과 화학 스크린을 통해 기본적인 발달 생물학에 걸친 다양 한 인간 질병 및 실험 연구의 증가 범위에 대 한 유용한 도구 강력한 모델로 떠오르고 있다. 그러나, 많은 실험, 특히 감염 및이 종이 식 모델에 관련 된 microinjection와 배아와 힘 드는 기법 기술 및 전문 지식이 필요로 하는 애벌레의 이미지에 의존 합니다. 정밀도 현재 microinjection 기법의 처리량을 개선 하기 위해, 우리는 이전에 복 부, 등, 또는 측면 방향 동양 zebrafish 태아 2 일 게시물 수정 (dpf)에 안정화를 microstructured 장치의 시리즈를 개발 합니다 절차입니다. 배아의 이미징에 도움, 우리는 또한 채널 4 zebrafish 유리 커버 슬립에 대 한 동시에 옆 방향으로 간단한 장치 설계. 함께, 우리가 여기 제시 도구 zebrafish 기술의 최적화를 위한 유용한 장치를 생성 하기 위해 photolithographic 접근의 효과 보여 줍니다.

여기서 설명 하는 접근은 (그림 1)의 설계 및 제조 2 dpf zebrafish, photolithographic (그림 2)와 소프트 리소 그래피 (그림 3) 기법을 사용 하 여 함께 사용 하기 위해 장치를 보여 줍니다. 이 방법을 사용 하면 많은 설계 반복 및 수정, 빠른 테스트 하 고 변경 및 개발의 다른 단계에서 제 브라와 함께 사용 하기 위해 ...

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K 조회수.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

비디오: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

시투에서 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레와 청소년의 혼성화

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

영장류 대뇌 오가노이드의 유전자 변형

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

저자 스포트라이트: 유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공법  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...