이 작품은 모나 쉬 대학, 국가 건강 및 의료 연구 위원회, 모나 쉬 폐 및 수 면 연구소에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 저자 confocal 현미경 이미징, 모나 쉬, 쥬 디 캘 러 한, 알렉스 Fulcher, Kirstin Elgass, 건강과 Camden Lo의 모나 쉬 마이크로 이미징 (MMI)에 임상 면역학의 직원 도움 감사 하 고 싶습니다 그리고 저자 MMI 시설 인정 모나 쉬 대학. 저자는 시설, 모나 쉬 조직학 플랫폼의 과학 및 기술적인 도움을 인정합니다.

이 프로토콜에 승인 하는 실험을 다음과 같이: (1) 윤리 위원회의 모나 쉬 의료 센터, 멜버른 대학교의 윤리 위원회에 의해 (2) 동물에 의해 인간.
 1. Bronchoalveolar 게 (BAL) 세포 <ol><li>에 폐 세포를 사용 하 여 발: (1) 인간의 내부 tracheal 포부를 사용 하 여 상계 6, 및 (2) 마우스 과목 13 . 
	참고: 대 식 세포의 인수는 일반적으로 이러한 세포의 일부 활성화를 발생합니다. 대 식 세포는 잠재적인 의료 문제를 조사 하는 상계를 필요로 하는 환자에서 얻은 고 모든 과목 (이 각 개별 프로젝트에 대 한 결정을 해야 합니다) 메츠의 분석에 적합 있을 수 있습니다.
	<ol><li>발 솔루션 및 회전 (10 분 동안 500 x g) 감소 형태로 펠 릿, 문화 매체 (로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 5% 태아 종 아리 혈 청 및 1 %L-글루타민), 실내 온도에 두 번 세척 및 다음 셀 문화 메디의 4 mL에 희석 음.</li>
		<li>필요한 경우 요청 정식 차동 수; 세포의 대부분 (일반적으로 &#62; 80%) 대 식 세포 6 됩니다. 
		참고:이 일반적으로 의해 수행 됩니다 다른 세포 유형 6의 morphologic 모양을 사용 하 여 임상 조직학 서비스.</li>
		<li>수행 가능한 대 식 세포 세포 Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 발 솔루션에 셀. 
		참고: 발 솔루션 단계 1.1에서에서 설명 했 듯이 인간과 쥐에서 얻은입니다.</li>
		<li>추가 1-4 × 10 5 대 잘 두고 당 문화 매체의 500 µ L에서 coverslips에 24-잘 접시를 37 ° C에서 하룻밤; 세포는 coverslips를 준수 합니다. 인간의 샘플에 대 한 항생제를 추가 (예: 페니실린, 스, 10 4 U/mL) 세균 오염을 방지 하기 위해.</li>
	</ol></li></ol> 2. 발 대 식 세포의 면역 형광 검사 레이블/현미경 참고: 위에서 언급 한 세포 coverslips에 준수.
<ol><li>문화 매체를 제거 하 고 셀 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)을 한 번 씻어. 10 분에 대 한 2 %paraformaldehyde / periodate/lysine (PLP) 정착 액 셀 수정</li>
	<li>PBS, 짧게 셀을 세척 하 고 0.2 %permeabilize에서 다음 20 분에 대 한 PBS에 트윈 20</li>
	<li>10%에서 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 30 분에 대 한 PBS에 희석 치킨 세라 블록 셀</li>
	<li>품 주 및 isotype 제어 항 체 37에서 1: 100 농도 (자세한 정보는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 실 온에서 1 h에 대 한 ° C. 
	참고: 벨 샘플에 대 한 대 식 세포의 특정 마커 일반적으로 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>기본 항 체의 추가 후 PBS, 셀을 세척 하 고 실 온에서 40 분 동안 해당 보조 항 체와 더 품 어.</li>
	<li>PBS에 마운트 장착 DAPI 기반 매체 레이저 업무가 647, 561, 488, 405 nm와 40 X (듯이) confocal 현미경을 사용 하는 시각화에 대 한 섹션을 세척, 1.0 나 오일 목표.</li>
</ol> 3. 폐 조직 샘플 참고: vivo에서 연구의 폐 조직, 관련 노출 후 샘플을 연구 (예를 들어, O에 의해 설명 된 대로 &#39; 설리반 외. 7).이 실험에 대 한 가장 관련성이 높은 노출은 감염 성 미생물, 특히 세균. 이 메서드에 사용할 수 있는 마우스 종자는 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스, 10-12 주 오래 된, 무게 25 ~ 30 g, 및 남성.
<li>Euthanize 쥐, 케 타 민 (400 mg/kg) 및 xylazine (40 mg/kg)의 복 주사를 통해 <ol>. 흉 강 열고 폐와 심장 외과 집게와가 위를 사용 하 여 노출 합니다.
	<ol><li>따뜻한 PBS 30 혈관에서 피를 우 심 실에 21-게이지 바늘을 사용 하 여 달 이다 s, 다음 30 2 %PLP 정착 액 10 mL를 주입 (우 심 실)에 s.</li>
		<li>오픈 흉 게를 따뜻한 PBS (42 ° C)를 사용합니다. 21 게이지 바늘와 0.8 m m 튜브 크기, 컷의 조각 기도 넣어야 하 고 주사 (42 ° C)를 미리 데워의 800 µ L, 3 %agarose 솔루션 포인트 낮은 녹는.</li>
		<li>넥타이 꼰 실크 (4.0 USP) 기관에서. 기도, 정의 삽입 지점 바로 아래 주위 스레드 놓고 간단한 overhand 매듭을 통해 그것을 보호 합니다. agarose를 공고히 폐 주위 얼음 처럼 차가운 PBS를 관리 합니다. 가 위 및 무딘 해 부를 사용 하 여 흉 강에서 블록으로 폐 및 심 혼을 제거 합니다. 개별적으로 각 폐를 제거 하 고 다음 16 h 2에 대 한 수정 %PLP 또는 말린 4 ° c.</li>
		<li>조직 단면까지 4 ° C에서 PBS에는 표본을 저장합니다. 폐 조직을 얻기 위해 이러한 방법은 앞에서 설명한 13 되었습니다.</li>
	</ol></li> <li>폐 조직 준비 샘플 사용 다음 단계.
	<li>10% 천연 버퍼링 말린 실 온에서 24 h에에서 수정 폐 조직 (3.1 단계에서 절제) 조직 <ol>. 75% 에탄올으로 전송 및 12 h 주기, (2.5 h 75 %EtOH, 절대 EtOH 3 h, 내용 제 3B, 그리고 파라핀에 3 h 3.5 h) 조직 프로세서에 넣어.</li>
		<li>소스를 실내 온도에 저장 되는 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 블록을 만드는 표준 파라핀에. 
		참고:이 단계에서 그것은 일반적으로 표준 슬라이드 폐 섹션을 잘라 편리한.</li>
		<li>FFPE 폐 섹션 4-5 µ m 두께 톰을 사용 하 여 자르고 충전, 코팅된 슬라이드 o 설명 이전에 마운트 &#39; 설리반 외. 7</li> <li>슬라이드 마운트, 60 mm x 24 mm coverslips (크기 1.5)에 장착 매체의 3 방울을 넣어, 반전 하는 coverslip에 슬라이드 및 초과 매체 밖으로 밀어. 밀폐 매니큐어와 함께 밀봉 하 고 상 온에서 저장.</li>
	</ol></li></ol> 4. 폐 조직 샘플의 준비/현미경 <ol><li>드 왁 스 rehydrate, 항 원 검색 솔루션 FFPE 폐 조직 샘플을 pretreat.
	<ol><li>오븐 건조는 FFPE 60 ° c.에서 60 분에 대 한 슬라이드 다음 실 온에서 5 분 동안 70% 에탄올 솔루션 30 분 및 전송 자일 렌 용액에 슬라이드를 넣어. 수돗물에 씻어.</li>
		<li>장소 열 플라스틱 랩에 여기 원 검색 10에서 10 분 압력 밥 솥에 따라 m/mol/L 트리 스, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 분, 로커에 다음 한 번 PBS를 가진 로커에 대 한 수도 물에 두 번 20 분 세척에 대 한 멋진.</li>
		<li>블록 5%에서 10% 닭 혈 청 실 온에서 30 분 동안 BSA/PBS.</li>
	</ol></li> <li>조직 얼룩.
	<ol>대 식 세포에서 메츠를 정의 1%에 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)을 추가 <li>1/100 희석 (항 체 금액에 대 한 특정 정보는 자료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 4 ° C에서 16 h BSA/PBS. 로커에 5 분에 대 한 PBS를 가진 두 번 세척.</li>
		<li>해당 보조를 가진 외피에 의해 달성 형광 탐지 항 체 1 %BSA에서 / PBS 실 온에서 40 분. 항 체는: (1) 닭 안티 마우스 488 (녹색), 닭 (2) 항 염소 594 (빨간색), 및 (3) 당나귀 반대로 마우스 647 (빨간색까지).</li>
		<li>PBS에 마운트 chromatin는 얼룩이 지기에 대 한 설치 매체 DAPI 포함 된 섹션을 세척.</li>
	</ol></li> <li>Confocal 레이저 스캐닝 머리는 거꾸로 한 현미경에 부착 된를 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.
	<li>Excite와 405, 488, 561, 647 준비 <ol>nm의 레이저 라인 연속 클릭 하 여 단일 면 512 x 512 픽셀 이미지를 캡처, 버튼 (2 라인 평균) 20 X 0.1을 사용 하 여 평준화 나 공기와 40 X 1.0 나 석유 목표.</li>
		<li>얻을 각 결과 (즉, 10 고 전력 분야의 보기 (HFOV) 10 자극된 샘플, 등, 각 마우스 컨트롤에 대 한)에 대 한 데이터 및 분석에 대 한 섹션 당 적어도 10 시야. 
		참고: 전체 분야의 대표적인 샘플을 얻기 위해 매트릭스 시스템 사용할 수 있습니다 필드 분할 하는로 다른 섹션 같은 매트릭스 보기의 필드를 선택 하는 각 서로 다른 샘플에 대 한 (예를 들어, 필드 9 섹션으로 분할 될 수 있다 그리고 센터 4 모서리에서 두 HFOV 찍힌다).</li>
	</ol></li></ol> 5. 3 차원 (3 차원) 이미징의 메츠 참고: 메츠는 3 차원 구조, 여러 z-스택 취 함으로써 이미지를 재구성 하는 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다.
<ol><li>1.8 m m와 0.1-0.5의 속도 설정 진폭에는 vibratome를 사용 하 여 200 µ m에서 파라핀 블록에서 폐 표본 섹션 m m/s.</li>
	<li>각각 혈 청 (10% 태아 종 아리 혈 청 및 10% 닭 혈 청)의 20%와 폐 조직 차단 하 고 보충 하는 PBS에 3.75 %permeabilize 다음 부드러운 동요에서 실 온에서 7 h에 대 한 Triton X 100.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 (항 체 농도 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 200 µ L 볼륨에 관련 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)와 4 ° C에서 16 h에 대 한 섹션을 얼룩.</li>
	<li>1 헤에 대 한 실 온에서 관련 2 차 항 체와 함께 배양 하기 전에 10 분 동안 3 번 PBS에 섹션을 씻어</li>
	<li>PBS에 슬라이드는 현미경 커버 전표를 추가 하기 전에 20 분 동안 솔루션에 폐 섹션 DAPI (1:5, 000)에 대 한 얼룩.</li>
	<li>형광 이미지를 거꾸로 confocal 현미경 (40 x 1.3 없음) 405 장비를 사용 하 여 얻을 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm, 그리고 635 nm 레이저.</li>
	<li>기록 최적의 z 40 x 1.3 나 오일 목표에 대 한 단면 0.54 µ m 두께의 3 차원 z-스택. 
	참고: 사용 하는 소프트웨어는 개별 현미경 따라 달라 집니다. 소프트웨어를 사용 하 여 한 현미경에는 어떻게 예를 들어 보조 파일 1에 제공 됩니다.</li>
</ol> 6. 분석 이미지 참고: 특정 이미징 분석 소프트웨어의 사용을 필요로 하는 샘플의 분석 및 예제 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 결과의 분석은 사용 하는 특정 프로그램에 따라 달라 집니다, 하는 동안 아래 나열 된 점은 중요 하다.
<ol><li>DAPI 위한 파랑 채널을 선택 하 고 셀에 대 한 최소 크기를 지정 하 여 분석의 발 샘플 <ol><li>정의 대 식 세포의 수 (예를 들어, &#62; 18 µ m 직경에서). 관련 소프트웨어를 사용 하 여 측정 필드 당 세포의 총 수.</li>
		<li>다른 마커 (예를 들어, MMP12, PAD2, 및 H3Cit)의 공동 식 DAPI에서 검색 하는 extracellular chromatin의 존재에 의해 메트로의 기능을가지고 있는 셀의 수를 세. 
		참고: 분석 될 수 있는 마커 수 레이저를 사용할 수의 수에 따라 달라 집니다 하지만 이상적으로 DAPI, 뿐만 아니라 다른 마커를 두 개 이상 포함 되어야 합니다. 다른 메트로 식 (예를 들면, extracellular chromatin와 진된 핵 세포의 수)에 대 한 특정 매개 변수를 덜 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>발에 메트로 식 비교 (는 제어, 연기, 연기/DNase 처리 그룹 사이), 샘플 분석 샘플 당 100 발 세포의 최소.</li>
		이차 항 체 isotype 측정 하 <li>형광의 수준을 제어; 그들의 형광에 대 한 각 샘플에서 100 셀의 최소 측정. 각 마커를 (예를 들어, H3Cit)에 대 한 배경 형광의 평균 수준을 측정 표준 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
		<li>메트로 식을 정의를 전형적인 형 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9 공동 식 extracellular chromatin)와 셀 그리고 각 메트로 대 한 마커 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9)의 형광의 수준을 측정. 셀 배경 및 isotype 컨트롤 위에 아니었다 그들의 얼룩이 메츠 생산 제외.</li>
		<li>인간의 발 샘플에 대 한 최소 100 셀 하 메츠는 대 식 세포의 비율에 대 한 각 샘플에 대 한 분석. Murine 샘플에 대 한 셀은 작은 고 메츠 힘들어 하 정의 분석 (예를 들어, 200 대) 각 샘플에 대 한 셀 수.</li>
	</ol></li> <li>폐 조직 샘플의 분석 <ol><li>폐 조직에 메츠의 존재를 확인 하려면 F4/80 등 특정 macrophage 마커.</li>
		<li>섹션 6.1에에서 나와 다른 매개 변수와 함께 extracellular chromatin를 표현 하는 셀에서 F4/80의 공동 지역화를 사용 하 여 폐 조직에 메츠의 존재를 정의.</li>
		<li>이차 항 체와 샘플에 배경 형광의 수준과 isotype 컨트롤을 결정합니다. 배경 위에서 하지 않은 분석에서 제외 하는 메츠.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation.">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li><li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

저자는이 작품에 관하여 있도록 아무 공개 있다.

이 리뷰에서 설명 하는 방법을 기반으로 그물14의 존재를 정의 하는 데 사용 되는. 대 식 세포는 지금까지 발 샘플에서 지배적인 셀 형식이 고 컬렉션의이 방법은 특히 메츠 공부에 대 한 적합 한. 적혈구는 발에 존재 하는 경우이 셀 염화 암모늄을 사용 하 여 lysed 한다. 발 절차 일반적으로 대 식 세포를 활성화 하 고 따라서 메츠 취소 자극 샘플에 있을 것으로 예상 된다. 발 대 식...

호 중구 extracellular 함정 (그물), Brinkmann 외. 에 의해 처음으로 설명 했다 1 그들은 주로 (특히 박테리아)에 감염에 대 한 응답에서 생산 되 고 호스트 방어1,2에서 중요 한 역할을 했습니다. 그들은 또한 맥과 반성 루 푸 스 (SLE);를 포함 하 여 비 전염 성 질병에 응답에 설명 되었습니다. 그리고 물질 phorbol 12-myrisate 13-아세테이트 (PMA)2,3. 그것은 최근에 다른 세포 유형 대 식 세포를 포함 한 extracellular 함정 생산 또한 수 있습니다 인식 하고있다. 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠)는 아직 문학4,5에서 잘 정의 된 엔터티. 우리는 최근 설립 메츠의 존재를 감지 방법을 생체 외에서 그리고 vivo에서6,7. 이 문서에서는, 메츠 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정을 설명 합니다.
(Apoptosis8) 같은 다른 세포질 통로에서 그것을 구별 하는 NETosis의 주요 특징은 함께에서 chromatin의 압출: 히스톤 (H3Cit)9(1) citrullination, (2)과 립 프로 테아 제10의 공동 식 , peptidyl 아르기닌의 deiminase (패드) 4의 (3) 참여11,12. 대 식 세포는 또한 H3Cit과 립 프로 테아 제, 그리고 패드, 표현 하 고 이러한 기능 메츠의 존재를 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.
메츠는 대 식 세포는 폐 포와 폐의 기도에 있는 지배적인 셀 고 감염/염증 세포 면역 반응을 지시에 초기 역할이 폐, 특히 중요 한 역할을 할 수 있습니다. 또한, 폐의 대부분은 빈 공간 (예를 들어,는 폐 포 내), 메츠 잠재적으로 단단한 장기와 달리 사용 가능한 공간으로 확장 수 있습니다.
그물의 존재를 정의 하는 가장 널리 사용 되는 방법은 confocal 현미경 검사 법입니다. 있다 아직 메츠를 측정 하는 명확 하 게 정의 된 방법. 그물의 측정에 대 한 기술이이 프로토콜에 메츠의 존재를 측정 하는 적응 하고있다. 이 메서드에 대 한 주요 요구 사항 분석 confocal 현미경 검사 법 및 적절 한 이미징 소프트웨어에 액세스할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human MMP12</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>NB110-57214</td>
			<td>1:100 concentration not quantifiable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MMP9</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>AB119906</td>
			<td>1:200 ascites, no concentration given</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB16478</td>
			<td>7 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NE</td>
			<td>LifeSpan Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse MMP9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AF909</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>In-house (hybridoma)</td>
			<td>In house</td>
			<td>20 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human &#173;&#173;&#173;&#173;PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-frost plus slides</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>S41104A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-prolong gold</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-goat AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>a-21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF 647</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>550878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1200 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue sources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>r8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent 3B</td>
			<td>Hi-Chem</td>
			<td>2026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 x 24 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c57 black 6</td>
			<td>Monash animal research platform (MARP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c</td>
			<td>MARP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

호 중구 extracellular 함정 (그물)의 존재를 정의 하는 데 사용 하는 기본 방법 confocal 현미경 검사 법 이다. 우리는 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠) 시각화 설립된 confocal 현미경 검사 법 방법 수정 했습니다. 이러한 extracellular 함정과 립 프로 테아 제, citrullinated 히스톤, peptidyl arginase deiminase (패드) 등 다른 부품의 공동 식 extracellular chromatin의 존재에 의해 정의 됩니다. 메츠의 식은 일반적으로 자극에 노출 후에 측정 하 고 유엔 자극 샘플에 비해. 샘플 배경 및 isotype 제어에 대 한 포함 됩니다. 셀 잘 정의 된 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. Confocal 현미경 검사 법 메츠의 존재를 정의 하는 데 사용할 수 있습니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 조직에.

메츠는 발 샘플, 폐 조직 및 3 차원 이미지와 두꺼운 폐 섹션에서에서 구상 될 수 있습니다. 발 샘플 시각 메츠의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 메츠의 형태는의 성숙의 단계에 따라 달라 집니다. 현미경에 첫 번째 감지 기능은 셀의 가장자리에 핵의 운동 이다. 이것은 H3Cit 및과 립 프로 테아 제와 같은 다른 공동 표현된 중재자와 extracellular chromatin 옵니?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K 조회수.  Monash Medical Centre. 대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

비디오: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em&gt; 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

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