Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal Monash University, National Health Medical Research Council e del polmone Monash e sonno Institute. Gli autori vorrei ringraziare lo staff di immunologia clinica presso Monash salute, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo di Monash Micro Imaging (MMI) per aiuto con la formazione immagine di microscopia confocale, e gli autori riconoscono le strutture MMI della Monash University. Gli autori riconoscono le strutture e assistenza scientifica e tecnica della piattaforma istologia Monash.

questo protocollo segue esperimenti approvati: (1) gli esseri umani dal comitato etico del Monash Medical Centre e (2) animali dal comitato etico dell'Università di Melbourne.
 1. lavaggio broncoalveolare (BAL) macrofagi <ol><li>BAL di uso per ottenere i macrofagi del polmone in: (1) umani soggetti di broncoscopia 6 e (2) topi mediante aspirazione endotracheale 13 . 
	Nota: Acquisizione dei macrofagi causa generalmente alcuni attivazione di queste cellule. I macrofagi sono ottenuti da pazienti che richiedono una broncoscopia per indagare un potenziale problema medico e non tutti i soggetti possono essere adatti per l'analisi dei METs (questo dovrà essere determinata per ogni singolo progetto).
	<ol><li>Prendere la soluzione BAL e spin-down (500 x g per 10 min) per formare una pallina, lavare due volte con terreno di coltura (Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) con 5% di siero fetale di vitello e 1% L-Glutammina) a temperatura ambiente e poi diluire le cellule in 4 mL di cultura medi um.</li>
		<li>Se necessario, richiedere una formale conteggio differenziale; la maggior parte delle cellule (generalmente &#62; 80%) sarà macrofagi 6. 
		Nota: Questo in genere viene eseguito da un servizio di istologia clinica utilizzando l'aspetto morfologico delle cellule differenti tipi 6.</li>
		<li>Eseguire una cellula macrofagica praticabile contare sulla soluzione BAL utilizzando esclusione in Trypan blue e un emocitometro. 
		Nota: Soluzione di BAL è ottenuta dagli esseri umani e topi come indicato al punto 1.1.</li>
		<li>Add 1-4 x 10 5 macrofagi a 24 pozzetti sulle lamelle in 500 µ l di terreno di coltura per bene e lasciare tutta la notte a 37 ° C; le cellule si atterranno alle lamelle. Per campioni umani, aggiungere antibiotici (ad es., penicillina e streptomicina, 10 4 U/mL) per prevenire la contaminazione batterica.</li>
	</ol></li></ol> 2. Etichettatura/microscopia di immunofluorescenza dei macrofagi BAL Nota: cellule siano rispettate su vetrini coprioggetti, come accennato in precedenza.
<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS). Difficoltà cellule nel fissativo di paraformaldeide/periodato/lisina (PLP) del 2% per un minimo di 10</li>
	<li>Lavare le cellule brevemente in PBS e quindi permeabilize in 0,2% Tween 20 in PBS per 20 min.</li>
	<li>Cellule di blocco con i sieri di pollo 10% a 5% albumina di siero bovino (BSA) diluito in PBS per 30 min.</li>
	Gli anticorpi <li>incubare con controllo primario e isotype per 1 h a temperatura ambiente a concentrazioni di 1: 100 (dettagli più specifici sono elencati in Tabella materiali) a 37 ° C. 
	Nota: Per i campioni di BAL, un marcatore specifico di macrofagi di solito non è necessario.</li>
	<li>Dopo l'aggiunta di anticorpi primari, lavare le cellule in PBS e incubare ulteriormente con i corrispondenti anticorpi secondari per 40 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le sezioni nel PBS e montare con il mezzo di montaggio a base DAPI per visualizzazione utilizzando un microscopio confocale (come detto sopra) al laser eccitazioni 405, 488, 561 e 647 nm e 40 X, 1,0 NA olio obiettivo.</li>
</ol> 3. Campioni di tessuto polmonare Nota: per studi in vivo del tessuto polmonare, studiare i campioni dopo l'esposizione pertinente (ad es., come descritto da O &#39; Sullivan et al. 7). l'esposizione più pertinente per questo esperimento sono microrganismi infettivi, soprattutto batteri. Diversi ceppi di topi che potrebbero essere utilizzati per questo metodo sono topi C57BL/6 o BALB/c, 10-12 settimane di età, peso 25-30 g e uomo.
<ol><li>Euthanize topi, tramite un'iniezione intraperitoneale di ketamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Aprire la cavità toracica ed esporre i polmoni e il cuore utilizzando forbici e pinze chirurgiche.
	<ol><li>Infondere PBS caldo usando un ago da 21 gauge nel ventricolo destro per lavare il sangue dai vasi per 30 s, poi infondere 10 mL di fissativo PLP di 2% per 30 s (nel ventricolo destro).</li>
		<li>Utilizzare calda PBS (42 ° C) per il lavaggio della cavità toracica aperta. Intubare la trachea con un ago da 21 gauge e un pezzo di tubo di 0,8 mm tagliato a misura e iniettare 800 µ l di pre-riscaldato (a 42 ° C), basso punto di fusione punto soluzione di agarosio 3%.</li>
		<li>Cravatta fuori la trachea con seta intrecciato (4.0 USP). Mettere il filo intorno alla trachea, appena sotto il punto di inserimento della cannula e fissarlo tramite un semplice nodo alla marinara. Per solidificare l'agarosio, amministrare ghiacciata PBS intorno ai polmoni. Rimuovere i polmoni e il cuore come un blocco dalla cavità toracica mediante dissezione smussa e forbici. Rimuovere ciascun polmone individualmente e quindi correggerli per 16 h a 2% PLP o formalina al 4 ° C.</li>
		<li>Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino al tessuto di sezionamento. Questi metodi per ottenere il tessuto del polmone sono stati descritti in precedenza 13.</li>
	</ol></li> <li>Per preparare il tessuto polmonare campioni attenersi alla seguente procedura.
	<ol><li>Fix del tessuto polmonare tessuti (resecati in fase 3.1) in 10% formalina tamponata naturale per 24 h a temperatura ambiente. Trasferimento al 75% di etanolo e messo in un processatore di tessuti su un ciclo di 12 h, (2,5 h in 75% EtOH, 3h in EtOH assoluto, 3,5 h in solvente 3B e per 3 h in paraffina).</li>
		<li>Embed in paraffina standard per creare formalina-fisse, paraffina-incastonato blocchi (FFPE) che sono immagazzinati a temperatura ambiente. 
		Nota: In questa fase, è generalmente opportuno tagliare le sezioni di polmone per diapositive standard.</li>
		<li>Tagliare le sezioni di polmone FFPE alle 4-5 µm spessore utilizzando un microtomo e montare sulla carica, come precedentemente descritti da O rivestito di diapositive &#39; Sullivan et al. 7</li> <li>per montare diapositive, mettere 3 gocce di mezzo di montaggio sulle lamelle 60 x 24 mm (misura 1,5), invertire la diapositiva il coprivetrino e spingere fuori l'eccesso del prodotto. Ermeticamente sigillare con smalto e conservare a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparazione/microscopia dei campioni di tessuto polmonare <ol><li>de-cera, reidratare e pretrattare il campione di tessuto FFPE polmonare con soluzione di smascheramento dell'antigene.
	<ol><li>Forno asciutto il FFPE diapositive per 60 min a 60 ° C. Poi mettere i vetrini nella soluzione di xilene per 30 min e trasferimento alla soluzione di etanolo 70% per 5 min a temperatura ambiente. Risciacquo in acqua di rubinetto.</li>
		<li>Posto in involucro di plastica resistente al calore e soggetti a recupero HIER-antigene in una pentola a pressione per 10 min a 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Raffreddare per 20 min. lavare due volte in acqua corrente per 5 minuti su un agitatore meccanico, poi una volta con PBS su rocker.</li>
		<li>Blocco con siero di pollo 10% a 5% BSA/PBS per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Macchiare il tessuto.
	<ol><li>Per definire METs in macrofagi, aggiungere gli anticorpi primari (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 1% BSA/PBS per 16 h a 4 ° C a diluizione 1/100 (informazioni dettagliate sulla quantità di anticorpo sono elencati in Tabella materiali). Lavare due volte con PBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.</li>
		Anticorpi di <li>raggiungere rilevazione fluorescente tramite incubazione con secondario corrispondente in 1% BSA/PBS per 40 min a temperatura ambiente. Gli anticorpi sono: (1) pollo anti-mouse 488 (verde), anti-capra pollo (2) 594 (rosso) e (3) asino anti-mouse (lontano rosso) 647.</li>
		<li>Lavare le sezioni in PBS e montaggio con DAPI-contenente di mezzo di montaggio per la macchiatura della cromatina.</li>
	</ol></li> <li>Ottenere immagini fluorescenti utilizzando un laser confocale scansione testa collegata ad un microscopio invertito.
	Laser: <ol><li>Excite la preparazione con 405, 488, 561 e 647 nm. Catturare immagini a 512 x 512 pixel singolo aereo facendo clic sulla linea-sequenziale, livellamento button (2 in linea media) utilizzando 20 X 0,1 NA aria e 40 X 1.0 NA olio obiettivi.</li>
		<li>Ottenere almeno dieci campi di vista per profilato per analisi e dati per ogni risultato (vale a dire, 10 campi di vista ad alta potenza (HFOV) per il controllo, 10 per il campione stimolato, ecc., per ogni mouse). 
		Nota: Per ottenere un campione rappresentativo di tutto il campo, può essere utilizzato un sistema a matrice in cui il campo è diviso in diverse sezioni per ogni campione diversi la stessa matrice viene utilizzata per selezionare i campi di vista (ad esempio, il campo può essere diviso in 9 sezioni, e dal centro e 4 angoli, sono presi due HFOV).</li>
	</ol></li></ol> 5. Tridimensionale (3D) Imaging di METs Nota: come METs sono strutture 3-d, prendendo più z-stack di immagini, che vengono ricostituiti, possono dare informazioni preziose.
<ol><li>Sezione gli esemplari del polmone da blocchetti di paraffina, a 200 µm usando una vibratome ad un'ampiezza impostata a 1,8 mm e velocità di 0,1-0,5 mm/s.</li>
	<li>Bloccare tessuto polmonare con il 20% del rispettivo siero (10% di siero fetale di vitello e pollo 10% siero) e poi permeabilize in PBS completati e al 3,75% Triton-X100 per 7 h a temperatura ambiente sotto agitazione delicata.</li>
	<li>Macchia le sezioni per 16 h a 4 ° C con gli anticorpi primari pertinenti (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 200 volumi di µ l in microcentrifuga (concentrazioni anticorpali sono elencate in Tabella materiali).</li>
	<li>Lavare le sezioni in PBS, 3 volte per 10 min prima incubazione con gli anticorpi secondari pertinenti a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Macchia le sezioni del polmone per DAPI (1:5, 000) in soluzione per 20 minuti, prima di aggiungere i vetrini al microscopio le diapositive in PBS.</li>
	<li>Ottenere immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio confocale invertito (40 x 1.3 NA) dotato di 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm e 635 nm laser.</li>
	<li>Registrare 3D z-pile di 0,54 µm spessore con z-sezionamento ottimo per l'obiettivo di olio NA 40 x 1.3. 
	Nota: Il software utilizzato variano a seconda il microscopio individuo. Un esempio di come il software può essere utilizzato per uno microscopio viene fornito in File supplementari 1.</li>
</ol> 6. Analisi dell'immagine Nota: l'analisi dei campioni richiede l'utilizzo di specifici software di analisi di imaging ed esempi sono elencati nella Tabella materiali. Mentre l'analisi dei risultati dipenderà il programma specifico utilizzato, i punti elencati qui sotto sono importanti.
<ol><li>Campioni di analisi di BAL <ol><li>definire il numero di macrofagi selezionando il canale blu per DAPI e assegnando una dimensione minima per le celle (ad es., &#62; 18 µm di diametro). Misurare con il relativo software, il numero totale dei macrofagi per ogni campo.</li>
		<li>Contare il numero di cellule che hanno le caratteristiche di un MET dalla presenza di cromatina extracellulare rilevata da DAPI con co-espressione di altri marcatori (ad es., MMP12, PAD2 e H3Cit). 
		Nota: Il numero di marcatori che possono essere analizzati dipende dal numero di laser disponibili, ma idealmente oltre DAPI, almeno due altri indicatori dovrebbero essere inclusi. Altri meno parametri specifici per espressione di MET (ad es., numero di cellule con cromatina extracellulare e un nucleo allargato) può essere utilizzato.</li>
		<li>Per confrontare l'espressione di MET in BAL campioni (tra il controllo, fumo e fumo/dnasi trattata gruppi), analizzare un minimo di 100 macrofagi BAL per esempio.</li>
		<li>Per misurare anticorpo secondario e isotype controllare i livelli di fluorescenza; misurare un minimo di 100 cellule in ogni campione per loro fluorescenza. Misurare il livello medio di fluorescenza di fondo per ogni indicatore (ad esempio, H3Cit) utilizzando software standard.</li>
		<li>Per definire l'espressione di MET, contare le cellule con il fenotipo tipico (ad es., cromatina extracellulare con co-espressione di H3Cit e MMP9) e per ogni MET, misurare il livello di fluorescenza degli indicatori (ad es., H3Cit e MMP9). Escludere le cellule che producono METs se loro colorazione non era sopra controllo di sfondo e isotype.</li>
		<li>Per campioni umani di BAL, analizzare un minimo di 100 celle per ogni campione per la percentuale dei macrofagi che rendono METs. Per esempi di murini, come le cellule sono più piccole e METs sono più difficili da definire, analizzare un numero maggiore di celle per ogni campione (ad es., 200 macrofagi).</li>
	</ol></li> <li>Analisi dei campioni di tessuto polmonare <ol><li>per determinare la presenza di METs nel tessuto polmonare, utilizzare indicatore specifico del macrofago come F4/80.</li>
		<li>Definire la presenza di METs nel tessuto polmonare utilizzando la co-localizzazione di F4/80 in cellule che esprimono extracellulare della cromatina con altri parametri, come indicato nella sezione 6.1.</li>
		<li>Determinare i livelli di fluorescenza di fondo nei campioni con anticorpo secondario e i controlli di isotipo. METs di escludere dall'analisi che non sono sopra sfondo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1 (2013).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).</li><li>O'Sullivan, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation.">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li><li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative per rendere in relazione a questo lavoro.

Il metodo descritto in questa recensione è basato su quello utilizzato per definire la presenza di reti14. I macrofagi sono di gran lunga il tipo di cella dominante in campioni BAL e questo metodo di raccolta è particolarmente adatto per lo studio di METs. Se i globuli rossi sono presenti nel BAL, queste cellule dovrebbero essere lisate utilizzando cloruro di ammonio. La procedura di BAL generalmente attiva i macrofagi e pertanto si prevede che ci saranno METs presenti in campioni non-stimolati....

Trappole extracellulari del neutrofilo (reti), furono descritti per la prima volta da Brinkmann et al. 1 essi sono principalmente prodotte in risposta all'infezione (soprattutto ai batteri) e hanno un ruolo importante nella difesa ospite1,2. Sono stati descritti anche per verificarsi in risposta a malattie non infettive, compreso vasculitis ed eritematoso di lupus sistematico (SLE); e al mitogene phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente è stato riconosciuto che altri tipi delle cellule possono anche produrre trappole extracellulari, tra cui i macrofagi. Trappole extracellulari del macrofago (METs) non sono ancora un'entità ben definita in letteratura4,5. Recentemente abbiamo stabilito i metodi per rilevare la presenza di METs sia in vitro che in vivo6,7. In questo articolo, descriveremo la misurazione dei METs usando la microscopia confocal.
Caratteristiche principali di NETosis che lo distinguono dalle altre vie cellulari (ad esempio apoptosi8) sono l'estrusione della cromatina in collaborazione con: (1) citrullination di istoni (H3Cit)9, (2) co-espressione delle proteasi granello10 e (3) coinvolgimento del peptidil arginina deiminasi (PAD) 411,12. I macrofagi esprimono anche H3Cit, proteasi granello e PAD, e queste caratteristiche possono essere utilizzate per definire la presenza dei METs.
METs può avere un ruolo particolarmente importante nel polmone, come il macrofago è la cella dominante presente nelle vie aeree del polmone e gli alveoli e ha il ruolo iniziale nel dirigere la risposta immunitaria cellulare all'infezione/infiammazione. Inoltre, mentre gran parte del polmone è spazio vuoto (per esempio, all'interno di alveoli), i METs sono potenzialmente in grado di espandersi nello spazio disponibile, in contrasto con gli organi solidi.
Il metodo più utilizzato per definire la presenza di reti è mediante microscopia confocale. Non c'è ancora un modo chiaramente definito per misurare METs. La tecnica per la misurazione delle reti è stata adattata per misurare la presenza dei METs in questo protocollo. I requisiti principali per questo metodo sono accesso alla microscopia confocale e appropriato software di imaging per l'analisi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human MMP12</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>NB110-57214</td>
			<td>1:100 concentration not quantifiable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MMP9</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>AB119906</td>
			<td>1:200 ascites, no concentration given</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB16478</td>
			<td>7 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NE</td>
			<td>LifeSpan Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse MMP9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AF909</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>In-house (hybridoma)</td>
			<td>In house</td>
			<td>20 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human &#173;&#173;&#173;&#173;PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-frost plus slides</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>S41104A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-prolong gold</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-goat AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>a-21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF 647</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>550878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1200 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue sources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>r8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent 3B</td>
			<td>Hi-Chem</td>
			<td>2026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 x 24 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c57 black 6</td>
			<td>Monash animal research platform (MARP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c</td>
			<td>MARP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

Un metodo primario impiegato per definire la presenza di trappole extracellulari del neutrofilo (reti) è la microscopia confocale. Abbiamo modificato i metodi di microscopia confocale stabilito per visualizzare trappole extracellulari del macrofago (METs). Queste trappole extracellulari sono definite dalla presenza di cromatina extracellulare con co-espressione di altri componenti quali le proteasi del granello, citrullinato istoni e peptidilico arginasi deiminasi (PAD). L'espressione di METs è generalmente misurata dopo l'esposizione ad uno stimolo e confrontato ai campioni non-stimolati. I campioni inoltre sono inclusi per controllo di sfondo e isotype. Le cellule sono analizzate utilizzando software di analisi di immagine ben definita. Microscopia confocale può essere utilizzata per definire la presenza di METs sia in vitro che in vivo nel tessuto polmonare.

METs può essere visualizzato da campioni BAL, nel tessuto polmonare e nelle sezioni più spesse del polmone con immagini 3D. Nella Figura 1è riportato un esempio di METs visualizzati in un campione di BAL. La morfologia dei METs varierà secondo la loro fase di maturazione. La prima caratteristica rilevabile su microscopia è il movimento del nucleo al bordo della cella. Questa è seguita da extracellulare della cromatina con altri mediatori co-espressi, qu...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Monash Medical Centre. Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.

Video: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualizzazione non-litica Esocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm tra regni incrociati utilizzando la microscopia Confocal

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

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