우리는 기술 지원에 대 한 부인 아키코 시바타를 감사합니다. 이 작품 최고의 졸업 학교, 무거운 이온 치료제와 공학에 글로벌 리더 양성을 위한 프로그램에 대 한 교육, 문화, 스포츠, 과학, 그리고 일본의 기술에서 연구비 지원 했다.

1. 재료의 준비 <ol><li>압력솥 커버 전표.
	<ol><li>유리 비 커에 커버 전표 장소.</li>
		<li>호 유리 비 커를 커버.</li>
		<li>20 분에 대 한 15 psi에서 121 ° C에 고압</li>
		<li>문화 후드에 실 온에서 50 ° c.가 게에서 건조.</li>
	</ol></li> <li>고정 솔루션 준비: 3 %paraformaldehyde + 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 2% 자당.
	<ol><li>1000 mL 유리병 700 mL PBS와 30 g paraformaldehyde 추가. 
		주의: Paraformaldehyde 부식성, 적절 한 장갑을 착용 하십시오.</li>
		<li>전자 레인지를 사용 하 여 80 ° C에가 열 하 여 완전히 분해 paraformaldehyde. 
		주의: Paraformaldehyde 연기 독성, 마스크를 착용.</li>
		<li>하룻밤 실 온에 둡니다.</li>
		<li>추가 20 g 자당.</li>
		<li>1 총 볼륨을 추가 PBS L.</li>
		<li>약 수 50 ml에서 튜브입니다. -20 ° C에서 3 년 또는 4에서 3 개월간 고정 솔루션 저장 될 수 있다 ° c.</li>
	</ol></li></ol> 2. 세포 배양의 준비 참고:이 절차는 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
로그 성장 5를 유지 하기 위해 <ol><li>문화와 통로 U2OS 인간의 다리 셀. 
	참고: 다른 세포 유형 최적의 방사선 복용량을 결정 한 후에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 적신 종이 타월로 메스를 닦으십시오. 35 mm 셀 문화 접시에 커버 슬립을 배치, 메스를 사용 하 여 (이 단순히 라고도 &#34; 접시 &#34;). 
	참고: 한 접시에 커버 실수할 수는 실험에 따라 늘릴 수 있습니다 (토론 참조) 디자인.</li>
	<li>추가 1 mL 문화 미디어: 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 DMEM. 
	참고: 다른 미디어는 선택한 셀 형식을 사용할 수 있습니다.</li>
	종이 수건으로 닦아 <li>겸 70% 에탄올과 습. 커버 슬립의 중심을 잡고 부드럽게는 집게를 사용 하 여. 커버 슬립에 보류를 유지 하면서 접시에서 배양을 완전히 발음. 
	&#8203; 참고:이 단계는 접시 커버 슬립의 동원 정지 촉진.</li>
	<li>부착 배양된 세포를 트립 신 5를 사용 하 여 분리.
	<ol><li>배양 접시에서 발음.</li>
		<li>1 mL PBS를 추가 하 고 요리를 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>접시에서 PBS 발음.</li>
		<li>1 mL의 트립 신 [0.25w/v% 트립 신-1mmol/L EDTA] 요리 추가.</li>
		<li>품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 5 분.</li>
		<li>9 mL 문화 미디어 요리를 추가.</li>
		<li>1000 μ micropipette를 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션 준비.</li>
	</ol></li> <li>계산 셀 5.
	<ol><li>1.5 mL 튜브에 더하고 0.9 mL 세포 현 탁 액 0.1 mL 0.4 %Trypan 블루 솔루션.</li>
		<li>는 hemocytometer 적용 10 μ.</li>
		<li>검사의 수는 반전 단계 현미경 셀 (즉, 라이브) 흠 없는.</li>
	</ol></li> <li>15ml 튜브에서 3 mL 세포 현 탁 액 0.5 x 10 5 셀/mL의 조밀도에 문화 미디어에서 준비. 
	참고: 셀 밀도 실험에 따라 수정할 수 있습니다 필요 (내용 참조).</li>
	<li>부드럽게 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가.</li>
	<li>5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 품.</li>
</ol> 3. 방사선 주의: 신중 하 게 제조 업체에 따라 x 선 irradiator 처리 &#39; s 지침.
<ol><li>거꾸로 위상 현미경 세포 검사. 커버 슬립 하 고 살아있는 셀 연결 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>6 Gy 엑스레이와 접시를 비추는 (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ℃에서 72 h. 
	참고: 보육 시간 실험에 따라 변경 될 수 있다 (토론 참조) 디자인.</li>
</ol> 4. 고정 <ol><li>배양 접시에서 발음.</li>
	<li>사용이 위, 1000 μ micropipette의 끝을 잘라 팁 끝에서 5 mm. 
	참고: 컷된 팁 부드럽게 고정 솔루션을 적용 하는 데 도움이.</li>
	<li>접시의 측면 벽에서 접시에 1 mL (단계 1.2 준비) 고정 솔루션 컷된 팁을 사용 하 여 추가. 
	참고:이 단계 시간적 이며, 따라서 여러 샘플을 처리할 때 micropipette 팁을 변경 하지 않고 수행 되어야 한다. 접시의 바닥에 직접 고정 솔루션의 응용 프로그램은 세포를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>광장 문화 접시에 접시를 놓습니다. 흔들어 균등 하 게 커버 슬립 고정 솔루션 배포를 부드럽게 광장 문화 접시.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 품.</li>
	<li>접시에서 고정 솔루션 발음.</li>
	<li>접시의 측 벽에서 접시에 PBS의 2 개 mL를 추가. 
	참고: 응용 프로그램 PBS의 접시의 바닥을 직접 세포를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>접시에서 PBS 발음.</li>
	<li>4.7-4.8 두 번 반복 단계. 
	참고: 접시 저장 될 수 있다 4 ° C에서 1 주 동안 2 mL PBS에에서 목욕 커버 미끄러져와.</li>
</ol> 5. DAPI 얼룩 <ol><li>슬라이드 유리, 5 μ 1 μ g/mL DAPI 얼룩 적용 시 약. 
	참고: 시 약 얼룩 DAPI는 6 개월에 대 한 안정적인 저장 될 때-20 이하로 빛 으로부터 보호 ° c.</li>
	<li>접시에서 커버 슬립을 제거, 메스를 사용 하 여.</li>
	<li>종이 타월 커버 슬립의 가장자리를 만져 커버 슬립에 초과 PBS에서 그릴.</li>
	<li>마운트 커버 슬립 DAPI 셀 DAPI 얼룩 시 약에 노출 되는 있도록 슬라이드 유리에 시 약을 얼룩의 드롭에 거꾸로. 
	참고:이 단계는 시간적. DAPI에서의 건조 시 약 얼룩 이어질 수 있는 차선의 얼룩.</li>
	<li>샘플-20에서 1 년 동안 저장 될 수 있다 ° c.</li>
</ol> 6. 이미지 수집 <ol><li>검사에는 형광 현미경 샘플. 핵 DAPI 필터를 사용 하 여 시각화 됩니다. 
	참고: 중 하나는 20 X 또는 60 X 오일 렌즈를 사용할 수 있습니다, 연구원에 따르면 &#39; s 관심. 60 X 오일 렌즈를 사용할 때 커버 슬립에 오일 한 방울을 추가 합니다. 샘플; 렌즈를 만지지 마십시오 조심 그렇지 않으면, 렌즈 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>다음 설정 및 매개 변수는 CCD 카메라와 디지털 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 핵의 이미지: DAPI 필터, 단층 이미지, 1 X, 및 자동 노출의 이득.</li>
	<li>완료 이미지 수집: 20 X 렌즈 렌즈 클리너 적신 종이 타월로 닦아. 클로 프롬을 적신 종이 타월로 기름 렌즈 X 60을 닦아.</li>
</ol> 7. Clonogenic 세포 죽음 모드의 평가 <ol><li>계산된 핵의 총 수는 300에 도달할 때까지 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 기준을 충족 하는 핵의 수를 계산 하는 무작위로 선택 된 이미지에서. 각 실험 설정에 대 한 3 중에이 단계를 수행.
	<ol><li>Apoptosis에 대 한 기준: apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵) 6 , 7의 존재.</li>
		<li>기준 mitotic 재앙: 두 개 이상의 고유한 돌출부 또는 micronucl를 보여주는 핵의 존재이 8 , , 9 10.</li>
		<li>세포 노화에 대 한 기준: 노화 관련 heterochromatic foci (SAHF) (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재 2 , 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+after+irradiation:+how,+when+and+why+cells+die.">Cell death after irradiation: how, when and why cells die.</a> Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).</li><li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+(SAHF).">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).</li><li>Kobayashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+catastrophe+is+a+putative+mechanism+underlying+the+weak+correlation+between+sensitivity+to+carbon+ions+and+cisplatin.">Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin.</a> Sci. Rep. 7, 40588 (2017).</li><li>Amornwichet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon-ion+beam+irradiation+kills+X-ray-resistant+p53-null+cancer+cells+by+inducing+mitotic+catastrophe.">Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe.</a> PLoS One. , 115121 (2014).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).</li><li>Sawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+sulforaphane+as+a+radiosensitizer+for+murine+osteosarcoma+cells.">Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells.</a> Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).</li><li>Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Curr. Protoc. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+radiosensitization+of+glioblastoma+cells+by+the+poly+(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+E7016.">In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016.</a> Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer.">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).</li><li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+through+a+tragedy:+mitotic+catastrophe.">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li><li>Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+breaks+during+mitotic+catastrophe+trigger+&#947;H2AX-ATM-p53-mediated+apoptosis.">Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger &#947;H2AX-ATM-p53-mediated apoptosis.</a> J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).</li><li>Torres-Roca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+assay+of+tumor+radiosensitivity:+a+roadmap+towards+biology-based+personalized+radiation+therapy.">A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy.</a> Per. Med. 9, 547-557 (2012).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 첫째, 세포 해야 될 성장 문화 접시에는 단층으로 다층 셀 어렵습니다 DAPI 스테인드 핵의 형태 평가 실시 하기 때문에. 2.9, 단계에서이 끝에 인큐베이터에 문화 접시의 주의 전송 것이 좋습니다; 문화 접시의 동요 문화 접시의 중앙에 세포의 농도에 이르게 중단된 셀의 소용돌이 생성 합니다. 또한, overconfluence 다층 셀 선도 피해 야 한다. 이 위해, 단계, 2.7에서에서 문화 접시에 시드 셀 수 시간과 방사선 및 고정 사이의 간격을 두 배로 하는 인구에 따라 수정할 수 있습니다. 고정 시간에 약 80의 합류는 것이 좋습니다. 둘째, 속도 고정 및 DAPI 얼룩 (즉, 4-5 단계)에서 중요 하다. 이러한 단계에 대 한 시간에 관한 간 샘플 불일치가 형태학 평가 애매 한 것이 핵에 DAPI 신호 강도 발생할 수 있습니다.
2.2 단계에서 단일 문화 접시에 커버 슬립의 수를 증가 수 있습니다; 4 덮개 미 끄 러 짐의 최대 35 mm 접시에 놓일 수 있다 그리고 더 큰 접시를 사용 하 여 수를 더 증가 될 수 있다. 여러 표지 전표 각 문화 접시에 배치 (즉, 커버 전표 관심의 여러 시간 점에서 문화 접시 하나 하나에서에서 수집 될 수 있습니다) 특정된 치료에 대 한 시간 코스 평가의 효율적인 운영 수 있습니다.
3.2 단계에서 방사선 복용량은 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 여러 셀 라인에 일관 된 복용량의 응용 프로그램에는 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 감도의 비교 수 있습니다. 다른 한편으로, 각 셀 라인에 대 한 iso clonogenic 생존 복용량의 사용 비교를 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음 프로필의 있습니다. Iso clonogenic 생존 복용량 clonogenic 생존 분석 결과12에의해 결정 될 수 있습니다. D10 값 10 %clonogenic 생존을 제공 하는 복용량 iso clonogenic 생존 복용량에 대 한 일반적인 끝점입니다.
3.3 단계에서 고정 하는 방사선에서 시간; 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 적외선 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 피크 시간 셀 라인 및 치료에 따라 다르기 때문에 이것이 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 clonogenic 세포 죽음 프로필, 우리의 그룹에 의해 여러 연구에 따라의 초기 심사에 가장 유용할 것 이다 시간 지점으로 방사선 조사 후 72 h를 사용 하 고 다른 설명 다음과 같습니다1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-레이-유도 된 apoptosis 단단한 종양에서 주로 설립 셀에 발생 하는 방사선 조사 후 몇 일. (두 번째 또는 세 번째에서 가장 눈에 띄게 발생 하는 암 세포에 mitotic 재앙 ii) X-레이-유도 방사선에 의해 유도 된 임시 세포 주기 검거에서 출시 후 유사 분열. 릴리스는 일반적으로 다음, 방사선 조사 후 약 24 시간 발생 반복된 mitoses 약 24 h. (iii)의 간격에 의해 X-레이-유도 세포 노화 된다 분명 후 셀 라인에 의존 간격: 2 일 후 일부 초기 사례 및 대부분의 셀 라인에 대 한 방사선 조사 후 7 일에 대 한 조사. 취득 후 clonogenic 셀의 전반적인 그림 죽음 프로필 초기 심사, 시간 과정 실험 clonogenic 세포 죽음의 상태 또는 특정 셀 라인의 각 모드에 대 한 피크 타임의 자세한 설명을 제공할 것입니다 이자4.
그 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 방사선 민감도 평가 대 한 표준 메서드는 주목 한다. Apoptosis와 mitotic 재앙만 시간 지속. 따라서, 주어진된 시간 지점에 대 한 분석 결과 얼룩 DAPI apoptosis와 평가의 시간 지점에 mitotic 재앙을 감지 합니다. 다른 한편으로, clonogenic 생존의 결과 포인트 apoptosis와 mitotic 재앙 발생 했다 잠복기 동안 일반적으로 방사선 조사 후 10-14 일의 총 금액을 포함 하는 주어진된 시간에 시험. Apoptosis와 mitotic 재앙, 노화 세포에서 다른 문화 접시;에 남아 그들은 방사선 조사 후 시간이 지남에 따라 점차적으로 축적. 따라서, 둘 다의 결과 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 반영 인큐베이션 기간 동안 발생 한 노화의 총 금액. 중요 한 것은, apoptosis, mitotic 혁명과 방사선에 의해 유도 된 노화의 비율이 다릅니다 널리 셀 선 및 방사선 복용량. 함께 찍은, 이론적으로, 한 시험의 결과 변환할 수 없습니다 그 다른 분석 결과에 직접.
DAPI 시험을 얼룩이 지는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, mitotic 재앙 세포 죽음의 다른 모드 인지 논란이 남아 있습니다. 방사선 생물학의 분야, mitotic 재앙은 clonogenic 세포 죽음1의 다른 장치에서 IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 간주 됩니다. 다른 한편으로, 다른 그 mitotic 재앙은 세포 죽음 그러나 apoptosis와 괴 사13,14를 포함 하 여 세포 죽음 앞에 오히려 프로세스의 고유 모드 논쟁. 따라서, apoptosis와 mitotic 재앙은 어느 정도 겹칠 수 있습니다. 둘째, 이전 연구는 세포 노화 일부 세포 치료 설정2에서 SAHF의 부재에서 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 각 clonogenic 셀을 위해 설계 된 현재, 다른 분석 실험에서 죽음 모드는 주어진된 실험의 결론의 견고성을 높이기 위해 사용 되어야 한다. 셋째, 시험을 얼룩이 DAPI apoptosis, mitotic 재앙, 세포 노화 (예, 괴 사 및 autophagy) 이외의 clonogenic 세포 죽음의 모드 평가 수 없습니다. 넷째, 분석 결과 종양 방사선 치료 반응의 예측으로 얼룩 DAPI 유틸리티 하지 병원에 해명 되었습니다. 이 관점에서 clonogenic 세포 죽음의 총 금액을 평가, clonogenic 생존 분석 결과 상관 관계 SF2, 셀 2 Gy와 반구의 살아남은 분수 간에 설정 된 때문에 시험을 얼룩이 DAPI에 우수한 X-레이, 그리고 방사선 치료15종양 응답. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 데이터 수집을 위한 clonogenic 생존 분석 결과 주로 전문성의 높은 학위와는 오랜 기간 (즉, 14 일)에 대 한 요구 사항으로 인해 병원에 널리 활용 되지가 주목 된다. 비교 함으로써, DAPI 얼룩 분석 결과 대 한 절차 간단 하 고 시간이 크게 단축, 약 3-4 일, 결과를 생성. DAPI 얼룩의 유틸리티방사선 치료 종양 응답의 예언자로 서 분석 결과 가까운 장래에 병원에서 테스트 됩니다.
요약 하자면, 분석 결과 얼룩 DAPI clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 세 가지 주요 모드를 동시에 평가 하는 비용 효율적인 단계 분석 결과 이다. 이 이렇게 쉽게 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 시간 포인트, clonogenic 세포 죽음의 모드에 있습니다.

이온화 방사선 (IR) clonogenic 세포 죽음의 여러 모드를 유도합니다. Clonogenic IR 유도 된 세포 죽음에 대 한 연구는 암 방사선 요법의 치료 효능을 증가 하는 방법을 개발 뿐만 아니라 정상 조직에 IR의 독성을 이해 하기 위한 중요 합니다. Apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 IR1에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드. Apoptosis는 DNA 손상1에 의해 시작 된 세포 죽음의 통제 모드입니다. Mitotic 재앙은 배달된 DNA 이중 가닥 나누기1에서 발생 하는 탈 선 유사 분열으로 인해 발생 하는 세포 죽음 이다. 세포 노화는 돌이킬 수 없는 세포 성장 체포2;의 상태로 정의 됩니다. 세포 노화 세포 죽음 본질적 아니다, 하지만 그것은 clonogenic 세포 죽음의 모드 때문에 노화 세포의 clonogenic 생존 곧 note.
다양 한 세포 기반 분석 실험 개별적으로 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화를 평가 하기 위해 개발 되었습니다. Apoptosis 흐름 cytometry1터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉-끝 레이블 (TUNEL) 얼룩, annexin V 얼룩, DNA 파편 분석 실험, 그리고 하위-G1 세포 주기 단계 결정으로 평가 될 수 있다. Mitotic 재앙 면역 형광 mitotic 마커, MPM2, TUNEL 염색, 전자 현미경1등에 대 한 얼룩에 의해 평가 될 수 있다. 세포 노화 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 얼룩, 성장 검거 분석 실험, 및 전자 현미경1에 의해 평가 될 수 있다. 중요 한 것은, clonogenic 세포 죽음의 우세 모드 셀 라인 및 치료 설정3,4마다 다릅니다. 따라서, 주어진된 실험 설정에 대 한 clonogenic 세포 죽음의 전반적인 프로필, 명료 하 모든 죽음의 이러한 모드를 포함 분석 하는 여러 실험 해야 합니다 실시 함께, 노동 및 비용 집중입니다.
이 문서에서 우리는 apoptosis, mitotic 혁명과 IR3,4에 의해 유도 된 세포 노화를 동시에 평가 대 한 분석 결과 신속 하 고 비용 효율적인 단계를 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 각각 식별 DAPI 스테인드 핵의 각각 특징적인 형태학에 기반. 이 방법은 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 조사 대상 세포 조건에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 시간 포인트에서 clonogenic 세포 죽음 프로필에 대 한 심사를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 도움이 될 것입니다. 관심입니다.

<table><tbody><tr><td>cover slip</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>scalpel</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cell culture dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope</td><td>Shimazu</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>X-ray irradiator</td><td>Faxitron Bioptics</td><td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr><tr><td>square culture dish</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>slide glass</td><td>Matsunami</td><td>Pro-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI staining reagent</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope DAPI filter</td><td>Nikon</td><td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope lens (20&amp;times;)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &amp;lambda; 20X/0.75</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope lens (60&amp;times;, oil)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &amp;lambda; 60X/1.40 oil</td><td></td></tr><tr><td>oil</td><td>Olympus</td><td>N5218600</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>digital image acquisition software</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Document</td><td></td></tr><tr><td>lens cleaner</td><td>Olympus</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Wako</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>

one-step protocol for evaluation of the mode of radiation-induced clonogenic cell death by fluorescence microscopy

이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, IR, 즉, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드를 동시에 평가 대 한 신속 하 고 비용 효율적인 단계 분석 결과 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화 식별 됩니다 DAPI 스테인드 핵의 특징적인 형태학에 따라. Apoptosis는 apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵)의 존재에 의해 결정 됩니다. Mitotic 재앙은 두 개 이상의 고유한 돌출부 및 micronuclei 핵의 존재에 의해 결정 됩니다. 세포 노화 노화 관련 heterochromatic foci (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 쉽게 clonogenic 세포 죽음 모드 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 또는 시간 포인트를 사용 하 여 화면을 실험 수 있습니다.

예를 들어, U2OS 인간 다리 셀 6 Gy 엑스레이와 치료, 72 h에 대 한 인 큐베이 팅 되었고 DAPI 얼룩이 지는 프로토콜에 따라 분석 결과를 받게. 그림 1 apoptosis, mitotic 혁명과 60 × 오일 렌즈를 사용 하 여 얻은 세포 노화와 관련 된 일반적인 핵 형태학에 대 한 확대 된 이미지를 보여줍니다. Clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 대 한 특성 형태학에 대 한 단계 7.1.1-7.1.3를 참조 하십시오. 그림 2 20 X 렌즈를 사용 하 여 얻은 핵의 개요 이미지를 보여줍니다. 6 Gy 엑스레이와 방사선 유발 mitotic 재앙 자주, 자주, apoptosis와 세포 노화 거의. 이러한 방식으로, 낮은 배율 필드에서 검사는 주어진된 실험 설정에서 clonogenic 세포 죽음 프로필의 전체 그림을 한 눈에 파악 하 하나 수 있습니다. 그림 3 은 정량된 데이터의 그래픽 표현.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg"> 
그림 1: DAPI 스테인드 핵 보여주는 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화의 일반적인 형태학의 이미지를 확대. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이 함께 조사 했다. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵 이미지 오일 렌즈 X 60을 사용 하 여 인수 했다. 눈금 막대 20 μ m =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg"> 
그림 2: 개요 이미지 셀의 핵 DAPI 스테인드의 x-레이로 치료. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 원, apoptosis; 화살표, mitotic 재앙입니다. 눈금 막대 = 50 μ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg"> 
그림 3: x-레이로 치료 하는 세포에서 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 정량된 데이터. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 무작위 분야에서 총 300 핵 apoptosis (Ap), mitotic (MC), 혁명과 세포 노화 (Sns)에 대 한 평가 했다. 평가 3 중에서 수행 했다. 평균 값이 표시 됩니다, 그리고 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 Clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜

이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, 우리는 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)의 형태에 따라 clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 평가 하기 위한 1 단계 분석 결과 설명-스테인드 핵 형광 현미경 검사 법에 의해 시각.

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

one-step-protocol-for-evaluation-mode-radiation-induced-clonogenic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.2K 조회수.  Gunma University Graduate School of Medicine. 이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, 우리는 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)의 형태에 따라 clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 평가 하기 위한 1 단계 분석 결과 설명-스테인드 핵 형광 현미경 검사 법에 의해 시각.

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Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

연구

암 연구학

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

CAR 발현 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸 평가

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable fragment, scFv), with an accompanying intra-chain linker, followed by a hinge, transmembrane, and costimulatory domain. Modification of the intra-chain linker and hinge domain can have a significant effect on CAR-mediated killing. Considering the many different options for each part of a CAR construct, there are large numbers of permutations. Making CAR-T cells is a time-consuming and expensive process, and making and testing many constructs is a heavy time and material investment. This protocol describes a platform to rapidly evaluate hinge-optimized CAR constructs in Jurkat cells (CAR-J). Jurkat cells are an immortalized T cell line with high lentivirus uptake, allowing for efficient CAR transduction. Here, we present a platform to rapidly evaluate CAR-J using a fluorescent imager, followed by confirmation of cytolysis in PBMC-derived T cells.

저자 스포트라이트: High-Throughput Screening of CAR T-Cell Constructs for Enhanced Cytotoxicity and Immunologic Memory (세포독성 및 면역학적 기억 향상을 위한 CAR T 세포 구조의 고처리량 스크리닝) 

A protocol to evaluate quantitative tumor cell killing by Jurkat cells expressing chimeric antigen receptor (CAR) targeting single tumor antigen. This protocol can be used as a screening platform for rapid optimization of CAR hinge constructs prior to confirmation in peripheral blood-derived T cells.

형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...

<meta charset="utf8"></head><body>Clonogenic Assay를 사용한 환자 유래 종양 오가노이드의 방사선 반응

Live Imaging to Quantify Cellular Radiosensitivity in Patient-Derived Tumor Organoids

Radiation therapy (RT) is one of the mainstays of modern clinical cancer management. However, not all cancer types are equally sensitive to irradiation, often (but not always) because of differences in the ability of malignant cells to repair oxidative DNA damage as elicited by ionizing rays. Clonogenic assays have been employed for decades to assess the sensitivity of cultured cancer cells to ionizing irradiation, largely because irradiated cancer cells often die in a delayed manner that is difficult to quantify with short-term flow cytometry- or microscopy-assisted techniques. Unfortunately, clonogenic assays cannot be employed as such for more complex tumor models, such as patient-derived tumor organoids (PDTOs). Indeed, irradiating established PDTOs may not necessarily abrogate their growth as multicellular units, unless their stem-like compartment is completely eradicated. Moreover, irradiating PDTO-derived single-cell suspensions may not properly recapitulate the sensitivity of malignant cells to RT in the context of established PDTOs. Here, we detail an adaptation of conventional clonogenic assays that involves exposure of established PDTOs to ionizing radiation, followed by single-cell dissociation, replating in suitable culture conditions and live imaging. Non-irradiated (control) PDTO-derived stem-like cells reform growing PDTOs with a PDTO-specific efficiency, which is negatively influenced by irradiation in a dose-dependent manner. In these conditions, PDTO-forming efficiency and growth rate can be quantified as a measure of radiosensitivity on time-lapse images collected until control PDTOs achieve a predefined space occupancy.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 암 연구 및 맞춤형 의학 발전을 위한 방사선 요법 및 클론 생성 분석

Here, we detail a straightforward live imaging approach for quantifying the sensitivity of patient-derived tumor organoids to ionizing radiation.

환자 유래 종양 오가노이드에서 세포 방사선 민감도를 정량화하기 위한 Live Imaging

Radiation therapy (RT) is one of the mainstays of modern clinical cancer management. However, not all cancer types are equally sensitive to irradiation, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

생물학

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 Clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜

요약

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형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

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환자 유래 종양 오가노이드에서 세포 방사선 민감도를 정량화하기 위한 Live Imaging

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환자 유래 종양 오가노이드에서 세포 방사선 민감도를 정량화하기 위한 Live Imaging

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성