우리 박사 숀 리를 감사 하 고 자리와 그들의 친절 한 도움에 대 한 캐나다의 웨스턴 대학교의 싱 리 생산 배열. 우리는 샘플 서비스를 제공 하기 위한 조직 적합성 코어와 포괄적인 이식 센터의 노스웨스턴 대학 직원에 감사. 이 작품 보조 보드 노스웨스턴 메모리얼 병원, 그리고 노스웨스턴 대학에서 제공 하는 제이를 교수 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 되었습니다.

여기 설명 된 모든 방법을 노스웨스턴 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다 (IRB 프로토콜 #: STU00104680). 프로토콜의 전반적인 흐름은 그림 1에 나와.
 1. 기증자와 받는 사람 HLA 시퀀스 Bioinformatic 분석 <ol><li>IMGT/HLA 데이터베이스에서 시퀀스 검색 15.
	<li>장기 기증자와의 받는 사람 모두의 얻을 HLA 타이핑 보고서 <ol>. 
		참고: 기밀 의료 기록 보호 하기 위해 적절 한 절차를 활용 해야 합니다. 일반적으로, 연구 프로토콜 또는 실험 테스트의 기관 평가 위원회 (IRB) 승인이 기관 IRB 지침 당 필요 합니다. PCR 기반 입력 (높은 또는 낮은 해상도) 또는 시퀀싱 기반 입력 (SBT)에서 HLA 보고서 라면 1.1.3 단계로 직접 이동 합니다. 시퀀스/HLA 게놈 시퀀싱에서 가져온 그리고 그들은 완벽 한 이러한 시퀀스 직접 대신 사용 합니다. 때때로, 단지 불완전 한 입력 또는 시퀀싱 결과 사용할 수 있는 추가 단계 1.1.2 따라. 할당 하는 &#34; 누락 된 &#34; 단계 1.1.2에서에서 설명한 웹 도구를 통해 대립.</li>
		<li>오픈 웹을 다음과 같은 모호한 대립 유전자 조합 링크-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, 및 사용 하 여 검색 된 &#8220; 모호한 대립 유전자 조합 검색 도구 &#8221; 가상 대립 유전자를 검색 하는 기능. 그런 다음, 1.1.3 단계를 진행 합니다. 대립 유전자 이름을 입력 하려면.</li>
		<li>다음 IMGT/HLA 대립 유전자 쿼리 양식을 열고 웹 링크-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html, 및 입력된 제목 &#8217; s 대립 유전자 이름 (각각 개별적으로, 그림 2와 같이)에 &#8220; 검색 대 한 &#8221; 상자. 클릭은 &#8220; 지금 대립 유전자에 대 한 검색 &#8221; 단추. HLA 대립 유전자 이름이 표준 명명 시스템을 사용 해야 합니다 (즉, A *, A * 01, A * 01:01:01:01, 및 A * 01010101 같은 어떤 이전 지정).</li>
		<li>찾을 일치 하는 대립 유전자 이름을 화면에 표시. 대립 유전자 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>복사는 &#34; 단백질 시퀀스 &#34;, 헤더 줄의 아래 텍스트 문서에 붙여 넣습니다 그리고 &#34; &#62; 대립 유전자 이름 &#34;. 효과적으로, 텍스트 문서는 대립 유전자 이름 및 시퀀스의 FASTA (빠른-모든) 형식.</li>
	</ol></li> <li>유전자 기반 다중 수행 기증자와 받는 사람/환자 대립 유전자의 정렬.
	<li>하나 <ol>유전자 (즉, DQB1 * 03:01:01:01) 한 번에 복사 하 고 텍스트 문서에 기증자와 환자 FASTA 시퀀스 (기증자에서 2)와 두 개의 환자에서의 모든 4 개의 대립 유전자를 붙여 넣습니다. 이 시점에서, 그것은 차동 환자 대립 유전자 이름에서 기증자 대립 유전자 이름을 표시 하는 것이 중요 (옵션 차동 사용 낮은 경우; 대 위를 포함 하거나 별도로 기증자 대 표시 각 대립 유전자 이름에 구별 접두사 또는 접미사 확장을 만듭니다. 환자 대립 유전자)입니다. 정렬 순서는 순서의 어떤 쌍 든 지 사이 유사성 수준에 따라 단행 될 것입니다 다음 때문에 시퀀스의 입력된 순서가 중요 하지 않습니다.</li>
		<li>복사 및 붙여넣기 FASTA에 시퀀스 형식으로 위에서 (로 그림 3에서 본)는 &#8220; 입력된 시퀀스를 입력 &#8221; 클러스터 오메가 웹사이트에 상자: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.</li>
		<li>클릭 &#34; 작업을 제출 &#34; 매개 변수의 표준 설정을 사용 하 여:와 같은 &#34; PROTEINŔ 및 &#34; 숫자 승 Clustal &#34;. 클릭 하 여 정렬 수행 &#34; 제출 &#34;. 4 시퀀스의 정렬 화면 ( 그림 4)에 표시 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>기증자 전용 불일치 표시. 
	참고: 그것은 특별히 지적 한다 여기에서 주어진 유전자 시퀀스 시퀀싱 하지를 HLA 입력의 결과에 근거 했다 그. 따라서, 특정 기증자 받는 쌍에서 관련 시퀀스 변화를 놓칠 수 있습니다 위험이 있다. 이 잠재적인 문제 이상으로 완화 될 것 이다 더 많은 이식 센터 정확한 고해상도 입력을 채택 하 고 DNA 시퀀싱을 직접.
	<ol><li>복사 맞춤 텍스트를 텍스트 문서에 붙여 하 고 새 문서를 만듭니다. 정렬 된 파일의 포맷을 방해 하는 경우 글꼴 스타일과 크기를 변경 하 여 형식을 수정: 항상 사용 &#34; Courier New &#34; 행에 맞게 작은 종류 크기에 글꼴. 서식 문제를 해결 한 후 문서를 저장.</li>
		<li>수동으로 고유 기증자에 게 속해 있는 모든 일치 하지 않는 잔류물을 식별 하는 정렬 된 시퀀스를 검사 합니다. 각 구별 글꼴 색을 사용 하 여 이러한 기증자 특정 잔류물의 표시.</li>
		<li>기증자에 있는 모든 문자를 밑줄 &#39; s 시퀀스는 14 잔류물 모두 최대-확장 및 표시 된 기증자 전용 불일치의 다운스트림 (계산 불일치의 1 잔류물 마이너스 15 아미노산 펩타이드로).</li>
	</ol></li> <li>겹치는 시리즈 15-메 르 펩 티 드 순서 파생. 
	참고: 15-메 르 펩 티 드를 선택 하는 이유는 전형적인 epitopes 되 고 길이 4-9 아미노산의 일반적인 지식에 근거 했다. 따라서, 적용 될 때 우리는 &#34; 이동 창 &#34; 프로시저 4 아미노산 ( 그림 1), 15 아미노산 길이 우리의 선택의 스텝 크기를 왼쪽으로 15-4 = 11 아미노산 겹치는 어떤 이웃 펩 티 드 시리즈에서. 이론,이 11 아미노산 오버랩은 길이, 최대 9 아미노산의 모든 면역 epitopes를 커버 하기에 충분 아니 epitope 실수로 수 있도록 &#34; 분할 &#34; 배열에만 부분 시퀀스 반.
	<ol><li>밑줄이 시퀀스를 사용 하 여 서식 파일을 순차적으로 파생 짧은 시리즈에서 시리즈에서 어떤 두 개의 인접 한 시퀀스 간의 4 잔류물에 의해 중복 15 아미노산 시퀀스.</li>
		<li>복사 및 붙여넣기 스프레드시트 ( 그림 5)는 열 형식에서에 이러한 15 아미노산 시퀀스 기증자 대립 유전자의 해당 이름을 포함 하는 표기법 열 동반. Aa 잔류물 위치를 포함 하는 추가 열이 유용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>1.1.3에서 단계를 반복. 1.3. 각 HLA 대립 유전자 (즉, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1, DP) 기증자의 15 aa 짧은 시퀀스를 파생 하는 기증자와 받는 사람 쌍의에 대 한.</li>
	<li>복사 열을 만드는 긴 연속의 모든 15 aa 시퀀스는 기증자의 모든 대립 유전자에서 마스터 스프레드 시트에 모든 열을 붙여 넣습니다. 문서에서 (펩 티 드 순서)에 대 한 행의 총 수를 적어 둡니다.</li>
</ol> 2. 사용자 지정 배열 레이아웃 및 생산의 디자인 <ol><li>생성 해당 대립 유전자와 펩 티 드 순서의 스프레드시트 부름. 배열 20 행 및 30 열 및 20 x 30 = 600까지 저장할 수 있는 펩 티 드에 대 한 명소. 펩 티 드에 기록의 총 수에 따라 하나의 특정 기증자 로부터 1.5 단계 그리고 우리 류 외에 시도 했다 두 예제와 함께 우리의 과거의 경험을 기반으로. 17, 600 자리 배열 ~ 2 별도 이식 케이스에서 생성 된 모든 시퀀스를 저장할 수 있습니다.
	<ol><li>합리적으로 가장 e 계획600-자리 형식의 배열 내에서 펩 티 드의 세트에 맞게 fficient 방법.</li>
		<li>하나 이상의 주제는 하나의 전체 배열에 넣을 수 있는, 첫 번째 기증 후 빈 행을 삽입 &#39; 30 (배열에 있는 행에 관광 명소의 수)로 나눈 수 있는 행의 총 수에 맞게 s 시퀀스.</li>
		<li>즉시 다음 시퀀스의 첫 번째 집합에 대 한 마지막 빈 행, 두 번째 이식 사건에서 시퀀스 내용의 전체 열에 붙여 넣습니다.</li>
		<li>는 배열의 가득 아니 더 많은 경우 600 관광 명소를 초과 하지 않고 추가할 수 있습니다 때까지 이러한 단계를 반복 합니다. 전체 빈 행 하단에 작성 하는 경우 &#34; 이동 &#34; 두 기증자 세트 사이 위치를 빈 행. 이 넓은 공간을 경우 사이 왼쪽 게 3.2 단계 쉽게-다음 종합의 완료 후 막의 절단. 아래.</li>
	</ol></li> <li>배열 레이아웃의 맥락에서 펩 티 드 순서를 프로그램. 자리 합성기의 프로그램은의 시퀀스 (한 행 한 펩 티 드 순서), (대립 유전자 이름, aa에 대 한 추가 열 없이 간단한 텍스트 문서로 2.1.4 단계에서 결과 스프레드시트를 저장 하 여 직접 얻을 수 있는 텍스트 형식 위치 등).</li>
	<li>실행 자동화 된 펩 티 드 배열 합성 자리 합성기를 통해. 종합의 전체 작업은 Kudithipudi 외. 21에 상세 하다. 참고 두 배열의 Fmoc 합성 걸립니다 ~ 4-5 일.</li>
</ol> 3. 프로브 및 개인의 시간 시리즈에서 Reprobe Antisera 이식 받는.
 참고: 600-자리 막 배열 크기 ~ 7 cm x 13 cm는. 합성, 후 배열은 저장할 수 있습니다 실 온에서 건조 막으로 적어도 2 년 때 직접 빛 으로부터 차폐 된. 반복된 사용에 대 한 그의 장 수를 유지 하기 위해 막의 과도 한 접는 방지.
<ol><li>Rehydrate 에탄올 막 배열 및 펩 티 드 명소 Ponceau S.로 얼룩진 시각화
	<ol>막 rehydrate <li>배열 단계적 절차 리 외에 최적화 된 펩 티 드를 들고 24. <ol><li>100% 에탄올 20 mL에 배열 막 몰입할.</li>
			<li>추가 20 mL 증류수 50% 에탄올으로 솔루션을 희석 하 여 15 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
			<li>세 번 100% 물 40 mL를 집중 솔루션을 변경 하 고 각 시간 15 분을 품 어.</li>
			<li>예를 들어, 5 분에 대 한 세 번 20ml (Tris 버퍼 염 0.1%), TBST의 적절 한 작업 버퍼에서 세척.</li>
		</ol></li> <li>Ponceau S 합성 펩 티 드를 시각화 하는 배열의 얼룩 <ol><li>수산화 배열에 직접 사전 공식화 Ponceau S 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 ~ 30 품 어 떨고 s.</li>
			<li>실행 증 류 물 지속적으로 드 배경 Ponceau S 색 얼룩을 막. 과정에서 펩 티 드 명소 붉은 색의 표시 될 수 있습니다.</li>
			<li>개별 사례에 대 한 배열의 섹션 사이 신중 하 게 절단 하 여 각 기증자에 대 한 배열 부분을 구분 합니다. 각 배열의 방향을 표시.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>사전 블록 배열.
	<ol><li>블록 5%의 20 mL에 막 비-지방 우유 TBST 버퍼에 녹아. 이 우유 기반 솔루션 Ponceau S 컬러 드 얼룩 추가 됩니다. 깨끗 한 펩 티 드 이미지를 달성 하기 위해 여러 번 우유 버퍼를 교체.</li>
		<li>기록 유지 목적을 위해 휴대용 카메라 (예를 들어 그림 6 참조)를 사용 하 여 배열의 Ponceau S 이미지의 사진의 찍을.</li>
		<li>계속 5% 비-지방 우유 또는 락 2 h에 대 한 실 온에서 하룻밤에 4 ° C에서에 막의 차단.</li>
	</ol></li> <li>이식 원으로 품 배열. 
	참고: 그것은 이어야 한다 현상 prozone 라고 주의 또는 후크 효과 혈 청 항 체 분석에서 보완-종속 간섭에서 발생할 수 있습니다. 이 문제를 우회 하는 선택적 세럼 전처리 단계 혈 청 샘플의 EDTA 또는 열 비활성화로 여겨질 수 있다.
	<ol><li>블로킹 버퍼를 제거 하 고 세척 TBST의 20 mL와 함께 막 세 번 다음 날 5 분 동안 각 시간.</li>
		<li>2.5%의 20 mL를 받는 조 혈 청의 추가 20 µ L TBST 버퍼에 우유와 실 온에서 2-3 h에 대 한 막으로 품 어. 그의이 초기 라운드에서 것이 좋습니다 마지막 포스트 이식 혈 청 (또는 가능성이 가장 민감하게 혈 청) 시계열에서 사용 첫째 note. 이 사전 이식 시간 포인트에서 특히 시리즈에서 이전 표본 적은 다양 한 alloantibodies 시간이 지남에 개발 하는 경향이 있다고 가정 기반으로 합니다. 이 이렇게에서 신호 방해의 어떤 가능성 든 지 &#34; 이성 &#34; 라운드 프로브 사이 이식에 대 한 면역 반응으로 인해 진정으로 개발 된 alloantibody 반응에서 명확 하 게 구분할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>TBST의 20 mL를 사용 하 여 array를 세척 하 고 2 차 항 체로 품 어.
	<ol><li>씻어 3 시간 10 분 동안 막 때마다.</li>
		<li>또 다른 2 헤에 대 한 1% 우유와 함께 보충 TBST 버퍼에 1:10,000 희석에 염소 안티 인간 IgG-HRP (양 고추냉이 과산화 효소) 이차 항 체와 품</li>
	</ol></li> <li>세척 하 고 오 점 개발.
	<ol><li>씻어 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막 때마다.</li>
		<li>갓 luminol 솔루션의 5 mL을 사용 하 여 수행 향상 된 화학 (ECL) 과산화 수소 솔루션 개발 (1 분)에 대 한 막의 5 mL와 혼합.</li>
		<li>시각화 ECL 적합 한 영상 (즉, ChemiDoc 이미징 시스템이 나 Azure C600)를 사용 하 여 신호.</li>
	</ol></li> <li>스캔 및 오 점 계량.
	<ol><li>개발된 이미지 ( 그림 7, 낮은 이미지)를 저장 하 고 자리 강도의 정량화를 수행.</li>
	</ol></li></ol> 4. 임상 시계열 원으로 반응성 비교.
<ol><li>스트립 배열.
	<ol><li>이 시점에서 계속 항상 젖은 막.</li>
		<li>20 분 동안 37 ° C에서 상업 스트립 버퍼의 20 mL와 함께 배양 하 여 멤브레인을 제거 하 고 10 분에 대 한 세 번 TBST 가진 막 씻어. 다음 차단 (4.2 단계)와 다른 시간에 찍은 환자의 다른 혈 청을 사용 하 여 검색 (4.3 단계) 단계를 반복.</li>
	</ol></li> <li>블록 제거 막. 
	참고: 다음 스트립, 막의 시간 시리즈에서 동일한 환자에서 다른 혈 청의 또 다른 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다.
	<ol><li>이전 5% 우유 버퍼를 사용 하 여 막 차단 (단계 3.2 참조).</li>
	</ol></li> <li>같은 시계열 (3.3-3.6에서 반복 단계, 그림 7, 위 이미지에서에서 예제)에서 다른 원으로 reprobe. 
	참고: 제거 배열 다음 다른 혈 청 견본 reprobe를 사용할 수 있습니다. 이후는 펩 티 드 covalently 막의 지원 매트릭스를 활용은, 우리 배열 스트립과 그 perfo를 잃지 않고 사이클 reprobing의 최대 20 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다 보였다rmance.</li>
	<li>배열의 장기 저장.
	<ol><li>저장소 TBS 버퍼에 막 부식으로 0.02 %w / w 나트륨 아 지 드와 함께 보충. 봉인된 된 비닐 봉투를 사용 하 여 장기 보관을 위해. 직접적인 빛에서 보호에서 4 ° C에서 젖은 막 적어도 2 년 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 5. 데이터 수집 및 분석 <ol><li>수동으로 주석을 긍정적인 항 원 펩 티 드.
	<ol><li>긍정적인 항 체 신호를 보여주는 관광 명소를 찾아서 각 그들의 격자 위치 결정.</li>
		<li>긍정적인 펩 티 드에 대 한 마스터 워크시트에서 해당 행을 강조.</li>
	</ol></li> <li>검색 마스터 워크시트 ( 그림 7, 하단 목록)에 나열 된 펩 티 드 순서. 단계 1.4.1에서에서 설명 하는 디자인 원리에 따르면., 크게 겹치는 순서를 공유 하는 인접 직렬 명소 (15-4 = 11), 따라서 반응 epitopes 공유할 수 펩 티 드 연속 시리즈에서.
	<ol><li>연속적으로 발생 하는 어떤 긍정적인 반점 든 지 강조.</li>
	</ol></li> <li>일련 있는 각 펩 티 드에 대 한 최소 epitope 길이 결정.
	<ol><li>어떤 잠재적으로 공유 피토 프 시퀀스 세그먼트 반응 펩 티 드의 중복에 따라 하이라이트.</li>
	</ol></li> <li>구조적 모델 항 원 epitopes.
	<ol><li>얻을 프로토 타입 HLA 크리스탈 구조 단백질 데이터 은행에서 다음에 발견 웹 링크: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.</li>
		<li>Pymol (www.pymol.org에서 다운로드)에 HLA 구조 프로토 타입을 표시.</li>
		<li>지도 &#34; 또는 모델 반응 펩 티 드 순서 ( 그림 8)를 강조 표시 하 여 프로토 타입 HLA 분자의 3D 구조에 반대로 기증자 epitopes를 발견. 클릭 &#34; 표시 &#34;, 다음 &#34; 배경 &#34;, 선택 하 고 &#34; 화이트 &#34;. 이미지를 저장 하려면 &#34; 파일 &#34; 및 &#34; 다른 이름으로 이미지 저장 &#34; 파일 포맷을 선택 &#34; png &#34;.</li>
	</ol></li> <li>결과 보고 하 고 해당 대립 유전자에 반응 epitopes를 할당할.</li>
	<li>비교 가능한 경우 단일 원 구슬 (SAB) 결과 결과 배열. 
	참고: SAB 테스트 사용 하 여 단일 유전자 항 원 HLA 단백질의 고정된 패널 쪽으로 항 체 반응을 측정 합니다. 개별 펩 티 드 항 체 반응을 보여 주는 또한 SAB 패널에 포함 된 경우 배열와 SAB 결과 사이의 직접 비교를 허용 하는 특정 HLA 대립 유전자에 속한다. 우리의 이전 연구 17 펩 티 드 epitopes SAB.의 전반적인 반응에 크게 기여 하는 것을 건의 결과 간의 상관 관계의 높은 수준을 보였다 또한, 배열 결과 또한 아미노산-특이성의 레벨을 공개.
	여부에 대 한 정보를 제공 하 고 어떤 기증자 대립 후 이식 환자의 혈 청을 반응 <ol><li>얻기 SAB HLA 실험실에서 결과. 단계 5.5에서에서 결과입니다. 배열에 따라 분석 또한 alloantibody 반응성에 대 한 긍정적인 해당 기증자 대립 유전자에 대 한 정보를 제공.</li>
		<li>비교 SAB 및 배열 결과.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+epitopes+as+viewed+by+antibodies:+what+is+it+all+about?.">HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?.</a> Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).</li><li>Robinson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IPD+and+IMGT/HLA+database:+allele+variant+databases.">The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases.</a> Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).</li><li>Gabriel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+typing+by+next-generation+sequencing+-+getting+closer+to+reality.">HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality.</a> Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Anti-HLA+Antibody+Detection+Using+Personalized+Peptide+Arrays.">A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays.</a> Transplant Direct. 2 (11), (2016).</li><li>Frank, R., Overwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis.+Epitope+analysis+with+arrays+of+synthetic+peptides+prepared+on+cellulose+membranes.">SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes.</a> Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+protein-protein+interaction+sites+using+peptide+arrays.">Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays.</a> J Vis Exp. 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S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Kaczmarek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-specific+HLA+alloantibodies:+long-term+impact+on+cardiac+allograft+vasculopathy+and+mortality+after+heart+transplant.">Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant.</a> Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).</li><li>Claas, F. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+constituent+human+serum+antibodies+elicited+by+vaccination.">Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).</li><li>Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+processing+by+the+proteasome.">Antigen processing by the proteasome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).</li><li>Filippone, E. J., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Humoral+Theory+of+Transplantation:+Epitope+Analysis+and+the+Pathogenicity+of+HLA+Antibodies.">The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies.</a> J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).</li><li>Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acceptable+mismatch+program+as+a+fast+tool+for+highly+sensitized+patients+awaiting+a+cadaveric+kidney+transplantation:+short+waiting+time+and+excellent+graft+outcome.">The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome.</a> Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

여기서 설명 하는 자리 배열의 디자인은 이식 한 장기 기증자의 HLA 항 원에 대 한 alloantibody 특이성의 실험 연구입니다. 기존 SAB 클리닉에서 광범위 하 게 사용 분석 결과, 달리 항 배열 메서드는 개별 기증자의 진정한 HLA 시퀀스를 수용할 수 있는 유연한 디자인에 주요 이점이 있다. 곧 모호성16,27 없이 정확한 HLA 유전자 시퀀스 판독을 생산할 수 있을 것?...

전 세계에 걸쳐 정기적으로 실시 하는 기관 대체 요법 수백만의 목숨을 저장 하고있다. 동안 큰 번호 아직도 대기에 기증자 기관 (기관에 의해 제공 된 정보에 따르면 공급의 심각한 부족으로 인해 받을 수 단단한 장기 이식, 매년 미국에서 백만 명 당 약 100 환자에서 발생 조달과 이식 네트워크-OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). 장기 이식 기관 낭비 하 고, 생명을 구할 높은 규제는 하지만 이러한 규정을 알려 하는 데 사용 하는 과학적인 도구 효과에서 제한 됩니다. 예를 들어, 과학계는 완전히 HLA 분자의 높은 다형 상태를 인식 하 고 고해상도 입력 하 고 (SBT) 입력 시퀀스 기반을 사용 하 여 DNA의 정확한 유전 테스트 최근 몇 년 동안1, 에서 개발 되었습니다 그러나 2., alloantibody 검사 방법 아직 되지 않은 항 원 조사로 개별 HLA 시퀀스의 광대 한 다양 한 생산할 수 있게. 현재는 불변 패널을 사용 하는 표준 시험 ~ 100 유전자 항 원 HLA의 일반적인 이체의 구성 하는의 A, B, C, DQ, DP와 박사는 인구3,4,,56시퀀스. 자주, 실제 기증자의 HLA 시퀀스에에서 포함 되지 않은 강제 이식 의사와 외과 기증자의 실제 시퀀스와 해당 "표준" 사이의 공유 유사성에 따라 기증자 특정 반응성 추론 테스트 패널에는 테스트 설정7,8. 따라서, 그것은 때로는 거부 위험 항 체 테스트 결과9,10,,1112에 따라 신뢰할 수 있는 평가 하도록 도전. 따라서, 새로운 개인적으로 alloantibodies에 대 한 사용자 정의 테스트는 긴급 하 게 필요한13,14.
HLA 유전자는 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 수용 체를 면역 반응6에 있는 주요 기능을 인코딩합니다. HLA 유전자 인간 게놈6의 가장 다형성 유전자 알려져 있습니다. DNA의 급속 한 발전으로 인해 시퀀싱 HLA 유전자의 새로운 유전자 변형에 대 한 전략 (또는 단순히 대립 유전자 라고 합니다)는 폭발적인 속도15,16에서 발견 되 고 있다. 3 월 2017 년까지 16,755 검증된 대립 했다 입금 되었습니다 IMGT/HLA 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html)에 12,351의 클래스의 했다 내가 하 고 4,404 클래스 II 그룹의 했다. 강한 대조에서는,만 조금 100 가지 대립 유전자는 일상적으로 장기 이식에서 alloantibodies를 검색 하는 데 사용 되는 표준 단일 원 구슬 (SAB) 분석 결과에 표시 됩니다. SAB 메서드 cytometry 사용 Luminex 플랫폼을 기반으로 합니다. 이후 분석 결과 활용 생산, 작은 일괄 처리에 배치 variabilities 외 항, 불변 집합 개인 및 실험실5를 통해 튼튼하게 원으로 테스트 표준화 수 있다. 그러나,이 테스트는 특히 기증자 시퀀스는 결 석 하는 경우 기증자 대립 유전자에 대 한 구체적으로 개발 하는 모든 alloantibodies를 캡처할 수는 SAB에서 설정. 진정한 시퀀스에 따라 기증자의 항 원의 사용자 지정 생산 하는 데 필요한, 하지만 필요한 생산을 합리화 하 고 테스트 절차에 기술적도 전에 남아 있다.
우리는 최근 신장 이식 과목17의 타당성 조사에서 다른 방법론을 설명합니다. 메서드와 사전 조사에 대 한 펩 티 드 항 원은 배열 형식에 사용 후 세라 개별 과목의 이식. 각 배열이 했다 자리 합성 방법18,19,20,21,22,23 펩 티 드 항 원, 각 15 생산을 사용 하 여 사용자 지정 길이, 아미노산 완전히 기반으로 각 장기 기증자의 HLA 대립 유전자 a, B, C, DQA1, DQB1, DRB1. 자리 합성 표준 Fmoc 화학22 를 사용 하 여 셀 루 로스 멤브레인에 운영 되 고 완전 자동화 된 로봇 시스템19,21병행에서 사용자 지정 펩 티 드의 수백을 생산할 수 있다. 막 배열 스트립 및 사이클 reprobing의 여러 라운드를 견딜 수 있습니다. 우리의 회고전 연구17, 우리는 저장된 이식 antisera (즉, 이식 전후) 시계열에서 수집 된 항 원 패턴의 변화를 감지. 여기 우리는 제조, 원으로 조사 및 결과 분석 배열 디자인을 포함 하 여 워크플로에 대 한 기술 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 특정 선형 epitopes 이식 기증자의 HLA 분자에 대 한 alloantibodies를 감지 하는 위한 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="577">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Peptide array</td>
			<td style="width:141px;">INTAVIS Bioanalytical Instruments</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ethanol</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">E7023</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">P7170</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1706404</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">TBST</td>
			<td style="width:141px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:115px;">10711454001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Goat anti-human IgG&#8211;HRP&#160;</td>
			<td style="width:141px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">A18811</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1705061</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientifics</td>
			<td style="width:115px;">21059</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">ChemiDoc gel imaging system</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1708265&#160;</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

personalized peptide arrays for detection of hla alloantibodies in organ transplantation

장기 이식, 기능 및 장 수는 이식의 비판적으로 의존 인간 백혈구 항 원 (HLA)에 대 한 면역 거부 반응 제어 성공. 실험실 테스트 안티-HLA 면제, 기존으로 선물의 기반으로하는 조직 적합성 지침 또는 드 노 보 주요 이식 장벽을 구성 하는 HLA 항 체를 생성. 현재 테스트 ~ 100 미리 재조합 HLA 항 원에 대 한 고정된 된 이식 세라 프로브를 사용 하 여 단일 원 구슬 (SAB) 플랫폼을 기반으로 합니다. 그러나, 인 간에 있는 HLA 종류, 쌍둥이 이외의 HLA 시퀀스의 동일한 조합을 공유 하는 수 없이 두 개인의 훨씬 더 큰 다양 한을 존재 한다. HLA 타이핑과 직접 시퀀싱 기술 DNA 순서는 기증자의 사이 어떤 불일치를 정확 하 게 캡처할 수 있습니다 받는 사람의 HLA, SAB 분석 결과 시퀀스 표시에서 그것의 한정 된 다양성 때문이 정확 하 게 감지할 수 있는 동안 기증자의 HLA 불일치에 대 한 구체적으로 alloantibodies입니다. 우리가 감지 하 고 개인으로 반대로 기증자 HLA 항 체의 특성 다른 기술을 사용 하 여 보완 방법을 개발 하고자 했다. 검사 도구는 주문 펩 티 드 항 체 중재 거절에 대 한 위험을 평가 하기 위해 기관 수령인의 포스트 이식 세라 프로 빙에 대 한 기증자 HLA 파생 된 시퀀스의. 한 기증자 받는 쌍에 대 한 단일 배열에 600 독특한 펩 티 드까지 만들어집니다 기반으로 기증자의 HLA 단백질 시퀀스에 15-아미노 산 성 순서로 하나 이상 일치 하지 않는 찌 꺼 기를 들고 각 펩 티 드. 사전 및 사후 식을 세라가이 배열에 대 한 항 원 패턴을 비교를 우리의 파일럿 실험, 또한 관련 된 면역 epitopes를 정확 하 게 우리를 허용 하는 해상도와 안티-HLA 신호 수 있었습니다. 이러한 맞춤 항 배열 장기 이식 기증자 특정 HLA epitopes의 고해상도 검출 허용.

원래 연구 방법17상영 하는 배열을 사용 하 여, 우리는 신장 이식 과목 5 과목의 총 등록. 우리는 입력 결과 우리의 코 호트의 및 그들의 각각 기증자의 HLA를 얻은. 그들의 병력 및 유전자 항 체 titers SAB 테스트에서 우리에 게 제공 했다. 이 5 환자의 우리의 파일럿 연구에서 두 개의 다른 방법론 고안: 각 기증자와 받는 사람 쌍에 대 한 사용자 지정 된 펩 티 ...

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Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

personalized-peptide-arrays-for-detection-hla-alloantibodies-organ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K 조회수.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. 장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

비디오: Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

연구

생화학

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. It has been proposed that ApoBDs can aid cell clearance as well as intercellular communication through trafficking biomolecules. Conventional approaches used for the identification and isolation of ApoBDs are often limited by the lack of accurate quantification and low sample purity. Here, we describe a workflow to confirm the induction of apoptosis, validate ApoBD formation, and isolate ApoBDs to high purity. We will also outline and compare fluorescence-activated cell sorting (FACS) and differential centrifugation based approaches to isolate ApoBDs. Furthermore, the purity of isolated ApoBDs will be confirmed using a previously establish flow cytometry-based staining and analytical method. Taken together, using the described approach, THP-1 monocyte apoptosis and apoptotic cell disassembly was induced and validated, and ApoBD generated from THP-1 monocytes were isolated to a purity of 97-99%.

A workflow using flow cytometry or differential centrifugation is developed to detect, quantify and isolate apoptotic bodies from an apoptotic sample to high purity.

검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.