저자는 바 덴-뷔르템베르크 재단 "Bioinspired 소재 합성" 프레임 워크 (BioMatS-14)에 그들의 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

1. 하이드로 겔 준비
<ol>
	<li>BSA의 200 mg 이온된 H2O를 20% (w/v) BSA 주식 (재고 솔루션 A)을 만드는의 1 mL와 함께 믹스.</li>
	<li>THPC 솔루션 (134 mg/mL)의 이온된 수를 만드는 THPC의 4.835 mL와 혼합 165 µ L 재고 솔루션 (재고 솔루션 B).</li>
	<li>KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) 펩 티 드 (또는 동등한 세포 접착 펩 티 드)의 1 밀리 그램의 무게 그리고 살 균 H2O 10 mg/mL 해결책 (재고 솔루션 C)를 100 µ L에 희석. 참고:이 단계는 선택 사항이 고만 경우는 히드로 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 의미는 포함 되지 해야 합니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 바닥을 제거 하 고 이동식 플라스틱 랩으로 대체. 참고: 여기에 사용 되는 번호판에 대 한 하단의 쉽게 제거할 수 있습니다 각 잘;의 하단에 압력을 적용 하 여 얇은 플라스틱 하단 단순히 밖으로 떨어질 것 이다.</li>
	<li>BSA 재고 솔루션의 믹스 100 µ L (A) 및 THPC의 100 µ L 재고 솔루션 (B) (선택 사항: 재고 솔루션 C 공업화, 세포 접착 hydrogels 4 µ L) 하이드로 겔의 200 µ L를 96 잘 접시에. 중 합 후 균일 한 하이드로 겔을 보장 하기 위해 5 번 이상 아래로 pipetting으로 구성 요소를 믹스.</li>
	<li>모든 hydrogels는 제대로 생산 될 때까지 약 10 분 동안 실 온 (RT)에서 96 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>신중 하 고 천천히 접시의 아래쪽에서 플라스틱 포장을 제거 합니다.</li>
	<li>작은 스탬프를 사용 하 여 96 잘 접시에서 hydrogels 누르고 살 균 PBS, pH 7.4와 1.5 mL 튜브에 그들을 전송. 참고:는 hydrogels 약 4 mm의 직경 및 높이 8 m m의 원통형 모양이 있다.</li>
	<li>hydrogels 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 몇 개월까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
</ol>
2. 동결 된 Hydrogels
<ol>
	<li>살 균 이온된 H2O의 500 µ L와 1.5 mL 튜브와 뚜껑을 제거. 주걱을 사용 하 여 1.5 mL 반응 관에는 hydrogels 전송.</li>
	<li>1.5 mL 튜브 단단히 파라핀 영화-에 적어도 3 층 각 유리병에 대 한 포장. 바늘을 사용 하 여 튜브에서 가스 릴리스 수 있도록 영화에 있는 작은 구멍을 뚫.</li>
	<li>다음 단계 중 하나를 수행 하십시오.
	<ol>
		<li>액체 질소는 물과 히드로 완전히 고정 되도록 5 분 동안 솔루션에 유리병을 전송 합니다. 즉시 제거 후 액체 질소에서 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 건조 기 동결에 튜브를 전송 합니다. 참고:이 절차 결과 모 공에 대 한 10-15 µ m 반경에.</li>
		<li>천천히는 hydrogels 동결 하룻밤-20 ° C에서 튜브를 유지. 즉시 제거 후-20 ° C에서, 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 건조 기 동결에 튜브를 전송 합니다. 참고:이 절차에 대 한 모에 결과 반지름 µ m 50-60.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24 h (와 후에 하이드로 겔 주위 물의 완전 한 증발), 동결 건조 기에서 그것을 제거 하 여 소재를 녹여. 참고: 기 공 크기는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (단계 5, "하이드로 겔 시각화")와 함께 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 입자 침
<ol>
	<li>1.1-1.5 단계에 설명 된 대로 하이드로 겔을 준비 합니다.</li>
	<li>직접 구성 요소를 혼합 후 추가 NaCl 포화 (36 mg/mL)이 발생할 때까지. 솔트 크리스탈 흰색 침전으로 솔루션에서 볼 수 있습니다 때까지 소금을 추가 합니다.</li>
	<li>통에 96 잘 접시를 전송 하 고 중 합 일어난다 (약 10 분) 때까지 흔들어. 1.7-1.8 단계에 설명 된 대로 hydrogels는 접시에서 제거 합니다.</li>
	<li>하이드로 겔 템플릿에서 모든 소금 elute 하 통 (20 rpm)에 살 균 물에 RT에서 적어도 24 h hydrogels 품 어. 몇 개월에 대 한 PBS에 4 ° C에서 hydrogels를 저장 합니다.</li>
</ol>
4. 채널 형성
<ol>
	<li>1 단계에서 설명한 대로 hydrogels를 준비 합니다. 히드로 협공을 사용 하 여 솔루션에서 제거 하 고 높게 흡수 성 종이, 과잉의 물을 제거 드라이 아이스의 블록 위에 두십시오.</li>
	<li>고정 30 하이드로 겔의 블록에서 조심 스럽게 분리. 하이드로 겔;를 손상 하지 않습니다 조심 스럽게 주걱을 사용 하 여 블록 다쳤어요. 1.5 mL 튜브에는 히드로 전송 하 고 37 ° c.에 하룻밤 건조</li>
</ol>
5. 하이드로 겔 시각화
<ol>
	<li>PBS의 10 ml에서 rhodamine B의 1 마그네슘을 diluting 하 여 rhodamine B 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.001 mg/mL의 농도 도달할 때까지 PBS에서 rhodamine 재고 솔루션을 diluting 하 여 직렬 희석을 준비 (희석 비율: 100)</li>
	<li>스토리지 솔루션 (예를 들어, 단계 2.4에서에서.)에서 하이드로 겔을 제거 하 고 0.01 mg/mL rhodamine B 해결책의 1 mL 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. 실시간에서 rhodamine B 솔루션에 하룻밤 히드로 얼룩</li>
	<li>다음 날, PBS (pH 7.4)와 적어도 3 h에 대 한 세척의 10 mL를 시각화 하는 히드로 전송.</li>
	<li>잘 µ-슬라이드 8에 히드로 전송 및 PBS와 그것을 커버.</li>
	<li>블레이드를 사용 하 여 (약 0.5 m m에 높이) 히드로에서 작은 조각을 잘라.</li>
	<li>Confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 시각화 514의 파장에서 히드로 nm (목표: EC 계획-Neofluar 40 x / 1.30 오일 DIC M27, 비행기 스캔 모드: 514 nm, 및 확대/축소: 1 X).</li>
</ol>
6. 셀 문화 타당성
<ol>
	<li>멸 균 필터 모두 0.45 μ m 필터 솔루션 (A, B 및 C) 재고.</li>
	<li>1.1-1.4, 히드로 합 전에 셀 접착제 펩 티 드를 포함 하 여 단계에 설명 된 대로 하이드로 겔을 준비 합니다.</li>
	<li>구성 요소를 혼합 한 후 즉시 플라스틱 혼합물 µ-슬라이드 8에 하단 완전히 덮여 때까지 잘. 참고:이 단계 수행 되어야 합니다 신속 하 고 직접 부품, 후 중 합 슬라이드에 몇 분 안에 일어난다.</li>
	<li>문화 접착 세포와 통로를 표준 세포 배양 기술을 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션. 미리 데워 진, 무 균 DMEM 세포 배양 소 태아 혈 청 (FBS, 10% (w/v)), 페니실린-스 (1% (w/v)), 그리고 불필요 한 아미노산 솔루션 (MEM, 1% (w/v)) 보충으로 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>Neubauer 챔버 및 신중 하 게 피 펫 200 µ L 셀 (2 x 105 셀/cm2) 하이드로 겔 표면에 원하는 수의 계산 된 셀 계산.</li>
	<li>Μ-슬라이드 8 뚜껑으로 잘 커버 하 고 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 그것을 전송. 적어도 4 h 37 ° c.에 품 어</li>
	<li>세포 부착의 적어도 4 h, 후 셀 메 마른 세포 배양 PBS의 200 µ L 두 번 씻는 다.</li>
	<li>RT에서 10 분에 대 한 3.7% (v/v) 포름알데히드의 200 µ L로 셀을 수정 하 고 PBS로 두번 세척 (~ 200 µ L). 참고: 포름알데히드를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오.</li>
	<li>PBS로 두 번 5 분 세척에 대 한 0.1% 트리톤 X의 200 µ L 셀 permeabilize</li>
	<li>Phalloidin-rhodamine 셀 추가 하 여 PBS의 195 µ L methanolic 주식의 5 µ L 혼합 그것 셀에 실시간 얼룩에 20 분에 대 한 셀 어둠 속에 얼룩. PBS로 2 회 세척.</li>
	<li>514에 confocal 현미경을 사용 하 여 셀 접착 속성 조사 nm (목표: EC 계획-Neofluar 40 x / 1.30 오일 DIC M27, 비행기 스캔 모드: 514 nm, 및 확대/축소: 1 X). 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석 ( 테이블의 자료를 참조).</li>
</ol>
7. 하이드로 겔 속성
<ol>
	<li>붓기 비율입니다.
	<ol>
		<li>적어도 1 일 동안 37 ° C에서 hydrogels를 완전히 건조.</li>
		<li>각 히드로 무게 하 고 정확한 무게 합니다.</li>
		<li>1.5 mL의 PBS로 2 mL 반응 관을 채우십시오.</li>
		<li>이 2 mL 반응 관에는 히드로 전송 및 완전히 PBS에 몰두.</li>
		<li>PBS와 평형에 도달 하는 RT에 PBS에 적어도 이틀 동안은 히드로 둡니다.</li>
		<li>3 일 후, 솔루션에서는 하이드로 겔을 제거 하 고 히드로 표면에서 과잉의 물을 제거 하는 종이 티슈로 건조 합니다.</li>
		<li>무게는 하이드로 겔.</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여 붓기 비율 계산: 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg"> 여기서 Wd 는 말린된 젤 (7.1.2 단계.)의 무게와 Ws 젖은 젤 (단계 7.1.7)의 무게입니다. 붓기 비율 %를 100으로 곱하면 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pH 및 온도 안정성입니다.
	<ol>
		<li>15 mL 반응 관에 PBS의 5 mL을 전송.</li>
		<li>NaOH와 HCl. 가져와 적절 한 온도 (예, RT, 37 ° C, 또는 80 ° C) 솔루션 솔루션 적절 한 산도 (예를 들어, : pH 2, 7, 또는 10)을 조정 합니다.</li>
		<li>적절 한 솔루션으로 안정성에 대 한 조사 하는 히드로 전송. 필요한 경우 pH를 재조정 하 고 참고: 모든 hydrogels 해야 합니다 수 완전히 불이 시점에서 (붓기 비율 참조) 재료의 붓기 때문에 무게의 잘못 된 해석을 방지 하기 위해.</li>
		<li>특정 시간 간격 후는 하이드로 겔 (예를 들어, 최대 2 일 동안 각 시간) 솔루션에서 제거, 과잉의 물을 제거 하 고 그것의 무게를 매우 흡수 성 종이 휴지로 건조.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>효소 저하입니다.
	<ol>
		<li>300 U 트립 신 펩 신, 제조업체의 지침에 의하여의 재고 효소 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>적절 한 솔루션을 (예를 들어, 단계 1.8에서에서) 히드로 전송. 참고: 모든 hydrogels 해야 합니다 수 완전히 불이 시점에서 무게의 잘못 된 해석을 방지 하기 위해.</li>
		<li>특정 시간 간격 후는 하이드로 겔 (예를 들어, 각 시간) 솔루션에서 제거, 과잉의 물을 제거 하 고 그것의 무게를 매우 흡수 성 종이 휴지로 건조.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspheres+leaching+for+scaffold+porosity+control.">Microspheres leaching for scaffold porosity control.</a> J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).</li><li>Whang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bone+Regeneration+with+Bioabsorbable+Scaffolds+with+Novel+Microarchitecture.">Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture.</a> Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).</li><li>Ziv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+silk-alginate+hydrogel+scaffold+for+stem+cell+culture+and+transplantation.">A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation.</a> Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).</li><li>Butruk-Raszeja, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Athrombogenic+hydrogel+coatings+for+medical+devices--Examination+of+biological+properties.">Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties.</a> Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).</li><li>L&#252;, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoresponsive+injectable+hydrogel+for+three-dimensional+cell+culture:+chondroitin+sulfate+bioconjugated+with+poly(N-isopropylacrylamide)+synthesized+by+RAFT+polymerization.">Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization.</a> Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).</li><li>Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+perspectives+in+cell+adhesion:+RGD+and+integrins.">New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.</a> Science. 238 (4826), 491-497 (1987).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th...

Hydrogels는 많은 양의 물 바인딩 수 불용 성 3 차원 네트워크를 형성 하는 물자. 이러한 자료는 살아있는 세포에 대 한 우수한 환경 조건을 제공할 수 있습니다. 현재, 3 차원 하이드로 겔 구조의 세대에 그들의 화학 및 물리적 특성에 맞게 프로세스 개발에 관심이 증가 하고있다. 이 달성 되 면 세포의 성장 및 세포 행동의 조작에 대 한 템플릿이 생성된1,2,,34될 수 있습니다. 이러한 3 차원 구조 뿐만 아니라 기존의 2 차원 방법, 하지만 그들은 보다 더 자연스럽 고 현실적인 환경 또한 공개 새로운 가능성을 만들 줄기 세포의 성장에 대 한 또는 종양 모델5. 다른 재료는 젤6의 기 공 크기에 주로 의존 하는 특성의 범위를 소유한 다. 모 공 세포 문화 응용 프로그램, 조직 공학 및 줄기 세포의 감독된 성장에 중요 한 역할을 한다. 예를 들어, 매트릭스를 통해 확산 하는 산소와 영양분 그리고 충분 한 양의 세포7에 도달 할 수 있어야 합니다. 다른 한편으로, 유해한 대사 산물, 최대한 빨리 제거 되어야 한다 고 세포 성장 위한 충분 한 공간이 사용 가능한7수 있어야 합니다. 따라서, 재료의 기 공 크기, 속성 심각 하 게 영향을 미칠 행렬의 잠재적인 혜택 및 가능한 응용 프로그램. 재료의 특성에 따라, 다른 세포-성장 과정; 신경 구조의 형성을 포함 하 여 3 차원 세포 배양에서 발생할 수 있습니다. 성장과 분화의 피부 나 뼈 세포; 그리고 hepatocytes 또는 섬유 아 세포2,3,,89,10,11같은 특별 한 줄기 세포 라인의 감독된 성장. 또 다른 중요 한 포인트는 물질의 가능한 응용 프로그램에 영향을 미치는 외부 자극12쪽으로 그것의 안정성입니다. 예를 들어는 히드로 세포 배양 또는 인체에 기계적 무결성을 유지 해야 합니다.
최근 몇 년 동안, 강화, 3D 셀 문화 hydrogels에 연구와 많은 연구 시스템13의 3 차원 구조를 해결 하기 위해 실시 했다. 화학적 합성된 구성 요소 구성 Hydrogels 가장 일반적으로 쉽게 합성 및 화학적 수정 수 있고 그들은 높은 안정성을 전시 하기 때문에 조사 (주 외., 2011 리뷰 참조)5. 그러나, 단백질에는 많은 유익한 속성이:으로 소위 "정밀 고분자," 그들은 생체; 그들은 정의 길이; 그들은 상대적으로 쉽게 수정; 그리고 그들은 많은 수의 대상 사이트14,15. 이와 관련, 많은 분야에서 응용 프로그램에 대 한 매우 구체적인, 혁신적인 구조를 생성할 수 있습니다. 본이 연구에서는 단백질 기반 하이드로 겔16 자료의 3 차원 구조에 영향을 잘 설립 방법의 능력을 보여 주기 위해 사용 되었다. 또한, 능력과 기 공 세대에 적용도 조사 했다.
많은 다른 기술이 간단한 방법 및 재료 과학의 다른 분야에서 정교 하 고, 고도로 전문화 된 기술 모두를 포함 하 여 3 차원 구조를 수정할 수 있습니다. 광범위 한 기술을 잘 정의 된 구조17를 생성 하는 전기의 사용 이다. 충전된 섬유는 전기 분야에 의해 해결책에서 가져온 고 산소에 노출 시 응고. 이 방법에서는, 몇몇 미크론까지 여러 나노미터의 범위에서 섬유를 생산 수 있습니다. 추가 기술을 크기, 구조, 그리고 매트릭스 내의 숨 구멍의 배포를 조정 하는 소프트 리소 그래피, 사진 평판, 유체역학 초점, 전기 살포 바이오 인쇄18,,1920. 이러한 기술의 중요 한 결점은 특정, 비싼 장비 및 특수 화학 제품 또는 자료에 대 한 의존도. 또한, 이러한 기술을 경험 종종 단백질 기반 재료를 직접 양도 이며 화학 물질 및 방법의 많은 셀 호환 되지 않습니다.
다른 한편으로, 많은 기술을 쉽고 저렴 적용 하 고 재현 하 그들을 만드는 특별 한 장비에 의존 하지 마십시오. 구조 조작에 대 한 광범위 한 방법은 용 매 캐스팅21,,2223입니다. 입자 중 합 반응 전에 추가 되 고 솔루션 포화 homogenously 배포 됩니다. 중 합 후 희석 또는 pH 변화, 같은 조건의 변화를 모는 재료 내에서 유지 하는 동안 입자의 solvation에 지도 한다. 소금, 설탕, 파라핀, 젤라틴, 분필, 등이 기술에 사용 되는 화학 물질 저렴 하 고 쉽게 사용할 수 있다 동결에 부 어 hydrogels 동결 됩니다. 진공에서 액체 단계의 후속 승화는23,,2425수행. 네트워크에서 물 승화 만큼 부드러운 재료의 특정 3D 구조를 유지 하는. 가스 거품, 동안에 중 합, 젤21내 숨 구멍을 떠나는 해결책 가스와 스트리밍됩니다. 크기와 숨 구멍의 분포는 가스 흐름에 따라 조정할 수 있습니다.
형성 단백질 히드로, BSA는 tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium 염화 물 (THPC) 1 차 아민 4 무장 링커 분자26의 hydroxy 그룹 사이 공유 결합의 형성에 대 한 있도록 Mannich 형 반응에서으로 반작용 했다. 반응 발생 가능한 유해한 중간체 물질의 과도 한 씻기에 의해 제거 됩니다.
이 연구에서는 조작 하 고 숨 구멍의 크기에 맞게 다른 기술로 BSA 기반 소재를 치료의 가능성을 보여 줍니다. 각 기술을 사용할 수 있습니다 어떤 실험실에 전세계, 특별 한 장비는 필요 하다. 또한, 다른 매개 변수를 같은 붓기 비율, 효소 분해성, pH 안정성, 온도 감도, 검사 그리고 서로에 비해 특히 존중 다른 기술의 영향에 3D 아키텍처의 생성에. 마지막으로, 자료 했다 기능성 세포 배양 물질의 가능한 응용 프로그램을 조사 하기 위해 셀 접착제 펩 티 드와 함께. 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인 사용 되었다: A549 및 MCF7.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (high glucose)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acid Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>&amp;Ouml;lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Slightly toxic</td></tr><tr><td>Phalloidin-rhodamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>3.7% Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>F8775-25ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro; slide 8 well</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS peptide</td><td>UPEP Ulm</td><td>Custom sysnthesis</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 1.5 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 2 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>FreezeDryer Epsilon 1-6D,&amp;nbsp;</td><td>Christ, Osterode am Harz, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

easy manipulation of architectures in protein-based hydrogels for cell culture applications

Hydrogels 셀 문화 응용 프로그램 때문에 높은 수 화 셀 환경을 제공 하는 그들의 능력에 대 한 유망 자료로 인정 받고 있습니다. 3 차원 서식 파일의 필드는 자연적인 기질을 그 물질의 잠재적인 정체 때문 상승 이다. 단백질 기반 hydrogels가 있습니다 특히 유망한 functionalized 쉽게 수 있기 때문에 조정 가능한 물리 속성으로 정의 된 구조를 얻을 수 있습니다. 그러나, 천연 재료를 사용 하 여 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 macroporous 3D 템플릿의 생산 종종 합성 물질의 그들과 비교 된 그들의 약한 기계적 성질에 의해 제한 됩니다. 여기, 다른 방법을 macroporous 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 생산 하기 위해 평가 했다-하이드로 겔 시스템, 반경에서 10 ~ 70 µ m의 범위에서 조정 가능한 기 공 크기를 기반으로. 또한, 몇 백 미크론 긴은이 단백질 기반 자료 채널을 생성 하는 방법 설치 되었다. 모 공, 기 공 크기의 영향 비율, pH, 온도 안정성, 그리고 효소 저하 행동, 붓기 등의 소재 속성에 생산 하는 여러 가지 방법은 분석 했다. 기 공 크기 hydrogels confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 네이티브, 부푼 상태에서 조사 되었다. 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 타당성 단백질 시스템 및 두 개의 모델 셀 라인의 세포 접착제 RGD 펩타이드 수정을 사용 하 여 평가 했다: 인간 유방암 세포 (A549)와 adenocarcinomic 인간의 치경 기저 상피 세포 (MCF7).

Hydrogel development has become one of the most prominent fields in material research-related biological studies, with thousands of entries indexed in scientific research archives. Although the behavior of many systems is well studied, the manipulation of 3D networks, especially of sensitive protein-based materials, is often a major issue in material science. Another commonly underestimated challenge is the correct measurement of the native structure of a material using cryo electron micr...

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Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

easy-manipulation-architectures-protein-based-hydrogels-for-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.7K 조회수.  Ulm University. 단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...