Name: application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
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저자 박사 사무엘 H. 윌슨에서 국립 연구소의 환경 건강 과학이이 작품에 사용 된 셀 라인에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

저자는 공개 없다.

여기 설명 하는 조건을 사용 하 여, UV-A 또는 405 nm 레이저, 제조 업체에 의해 통합 또는 최종 사용자에 의해 추가 된 모든 confocal 현미경 세포의 핵 내 DNA 손상 유도 고 수의 사이트에 DNA 수 선 단백질의 신규 모집을 허용 모니터링할 DNA 손상을 유도 한다. 그러나, 프로토콜 및 대표 결과, 파장 선택 했 듯이 전원, 적용 하 고 손상을 특성화는 모든 중요 한 문제 해결 되어야 합니다 먼저 사용자가 특정 DNA를 연구 하기 위해 복구 통로. 또한, 사용자가 또한 고려 되어야 하는 실험 설계에서 다른 고려 사항이 있다.
라이브 셀 게시물에 단백질의 동작을 모니터링 하기 위해 마이크로-방사선, 붙일 레이블된 단백질 생성 되어야 합니다. 다양 한 괴기 하 게 분리 될 수 있다 형광 단백질의 가용성은 DNA 손상 유도 세포 응답을 특성화에 사용할 수 있는 단백질 융해를 만들기 위한 도구를 제공 합니다. 관심사의 형광 단백질의 과도 transfection 손상 조건, 돌연변이, 또는 심지어 억제제의 빠른 심사 안정적 transfected 세포를 제공 하는 동안 더 식 수준 이상의 제어 하 고 다른 생 화 확 적인 허용 수행 characterizations 마이크로 조사 결과 검증. 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 또한 동일한 경로 또는 다른 경로에서 단백질 간의 상호 작용을 모니터링 하는 같은 셀에 활용할 수 있습니다. 형광 단백질 또한 관심사의 각 단백질을 위한 특정 항 체에 대 한 필요성을 제거 하 고 라이브 세포 손상의 유도 후 오랜 기간에 대 한 단백질 동작의 모니터링 허용.
그러나, 형광 단백질의 사용 또한 단점이 있다. 유전 배경 관심의 protein(s) 부족, 없이 생 단백질 붙일 태그가 단백질 경쟁할 것 이다. 단백질의 N 또는 C terminus에 형광 태그의 활용 수 있습니다 단백질 접기 변경, 주요 단백질-단백질 상호 작용을 방해 또는 차단 전 신호; 기능을 변경 하 고 잠재적으로 모집 역학에 영향을 미치는입니다. 이러한 효과 다양 한 보고서를 극적으로 다른 모집 및 피해 사이트28생 단백질에 대 한 보존 시간 시연 immunofluorescent 얼룩에 입증 되었습니다. 과도 transfection 또는 안정적인 클론의 사용 또한 관찰, 일반적으로 단백질 표정 수준에 변화를 통해 응답을 변경할 수 있습니다. 또한, 단일 실험에서 여러 형광 단백질의 사용 또한 변경할 수 있습니다 모집의 역학 단백질 레벨은 잘 equilibrated 하지 또는 다른 단백질의 신규 모집을 차단 하는 큰 붙일 태그가 단백질의 신규 모집 . 마지막으로, 형광 단백질 약한 과민성 에이전트, 반응성 산소 종의 형성을 증가 하 고 잠재적으로 DNA 손상 혼합물 유도46,47변경으로 작동할 수 있다. 이러한 단점에도 불구 하 고 형광 단백질 공부 DNA에 뚜렷한 장점을 마이크로-방사선, 복구 및 사용자 설명 여기, 피해 특성 등의 적절 한 컨트롤을 통합 하는 경우에, 그들은 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다 제공 에 손상 응답 및 단백질-단백질 상호 작용3.
라이브 셀 이미징 필요 하지 않으면, 면역 형광 유도 된 손상에 대 한 응답을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 시간에 세포를 고정 하 여 손상 유도 및 항 체와 단백질 및 관심, 손상 유도의 정적 스냅샷 및 모집 병 변 및 단백질을 만들 수 있습니다 수리의 보존에 대 한 특정 얼룩 게시. 항 체는 관심의 포스트 번역 상 수정 DNA 손상 응답에 의해 유도 된 여러 단백질의 신규 모집을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 면역 형광의 사용 형광 성 단백질에 대 한 필요성을 제거 하 고 생 단백질 동작 검사를 허용 합니다. 그러나,이 메서드는 너무 그 단점이 있습니다. 매우 특정 항 체는 필요, 그리고 permeabilization 및 차단 절차 충분 한 신호 강도 가진 신규 모집의 검색 수 있도록 최적화 해야 합니다. 해결 절차는 순간, 고이 물리적 제약이이 접근의 시간 해상도 제한 합니다. 세포 염색 후 다시 찾을 수 있도록 손상 유도 사이트 매핑 또한 중요 한 과제를 제시할 수 있습니다. 이 작품에 사용 하는 confocal 현미경 수 있습니다 이미지 기반 등록 위에서 설명한 대로 그래서 손상 된 세포 높은 정밀도로 이전 될 수 있습니다. 고유한 간격으로 손상 유도 및 이미지 모집 된 결합 단계 등록을 하지 않고 재배치 세포 면역 형광을 만들 수 있습니다 단계 등록 또는 에칭된 coverglass 사용할 수 없는 경우, 투자에 참여 하는 시간 일부 사용자에 게 매력적. 그러나, 가장 정확 하 고 완전 한 마이크로 방사선 실험 디자인 제시 프로토콜에 설명 된 대로 이러한 유형의 형광 단백질의 사용과 동시에 접근을 통합할 예정 이다.
여기, 라이브 셀 이미징 및 면역 형광 레이저 마이크로-방사선의 유틸리티를 설명 하는 데 사용 됩니다. Immunofluorescent 얼룩 수 있도록 만든 DNA 손상의 혼합물을 정확 하 게 검사 하 고 더 나은 수 있게 하는 각 레이저 파워에 의해 유도 된 단백질의 채용 모집 및 XRCC1 GFP의 보존에 관찰된 변경 해석. 이러한 결과 바탕으로, 405 nm 레이저를 사용 하 여 BER 및 SSBR 단백질의 검사에 대 한 제한 되어야 합니다. 또한, 최적의 실험 설계 목적, 사용 하 고, 각 셀 라인에 대 한 전체 손상 혼합물 특성화 및 채용의 유효성 검사 후 전력 측정 포함 하 고에 놓여있는지 관찰 보존 태그와 단백질 면역 형광 검사입니다. 물론, 장비, 시간, 및 비용 고려 할 수 있습니다 이러한 최적의 실험 설계 불가능 한 일부 사용자에 대 한. 그러나, 이러한 요소 각각의 중요성은 여기, 증명 하 고 사용자가 이러한 고려 사항을 염두에 두어야 마이크로 조사 실험을 시작 하는 때.

형광 현미경 검사 법은 셀룰러 아키텍처를 시각화 하 고, 단백질 지 방화, 시험 하 고 단백질-DNA와 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링 하는 강력한 기법으로 떠오르고 있다. DNA 손상 응답 글로벌 DNA 손상 자외선 (UV) 등 에이전트의 응용 프로그램 후 공부를 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이온화 방사선, 화학 산화 alkylating 에이전트, 또는 chemotherapeutics 제공 하고있다 새로운 통찰력 시작, 신호, 및 DNA의 모집 단백질 DNA 손상1,2의 사이트를 복구 합니다. 그러나, 이러한 글로벌 및 손상 이벤트 비동기는 제한 경우 채용 순서, 협회 또는 분리의 활동에 대 한 자세한 정보 및 주요 DNA 수 선 단백질 사이의 관계는 모색 하 고 있다. 다행히, 레이저 confocal 현미경 검사에서 발전, 손상 유도 레이저 파장, 및 형광 단백질에서 지난 25 년 동안 개선의 광범위 한 가용성 제공 향상 된 도구와 연구원은 이러한 검사 타겟된 DNA 손상 유도 통해 DNA의 복구.
세포 및 subcellular 기능을 공부 하기 위하여 레이저 microbeams 셀의 조사는 셀 및 방사선 생물학3확고 도구입니다. DNA 수리의 학문에이 기술의 응용 프로그램 등장 Cremer 및 동료 사용 매우 초점을 맞춘 UV (257 nm) 중국 햄스터 난소 (CHO) 자리는 0.5 µ m 이상의 DNA 손상 유도 레이저 microbeam 체계4 세포와의 유도 설립 DNA photolesions이 시스템5. 동안 제공 크게 향상 UV microbeam 방법에 비해이의 입양 당시 시스템을 손상의 특수 설정, 및 생성을 하지 못하는 제한 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)6. 자외선 B (290-320 nm)와 UV의 다양 한 후속 조사-몇명의 그룹에 의해 (320-400 nm)의 파장 UV photoproducts, 산화 병 변, 기본 밝혀 단일 가닥 (SSBs), 휴식과 DSBs 레이저 파장에 따라 유도 될 수 및 파워4,7,8,,910 ( 3에서검토) 적용. 또한, 이러한 자외선-B와 자외선 파장 sensitizing psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU), Hoechst 염료, 같은 에이전트와의 조합 또한 발견 했다 파장, 전력, 그리고 노출의 기간에 DNA 손상을 유도 하 능력을 필요 유도 피해는 종종 이러한 에이전트11,12,13,,1415의 낮 췄 다. 이러한 방법의 더 넓은 채용을 위해 해결 되어야 아직 기술적인 장애물 있었지만 이러한 발전 마이크로-방사선의 사용 확대.
Cremer와 동료 셀에서 매우 지역화 된 영역 중요 한 파괴적인 에너지를 적용할 UV microbeam 정확 하 게 집중 하 여 마이크로-방사선 분야 고급 크게. Confocal 현미경과 레이저 서 시스템 고급, 긴밀 하 게 초점 맞춘된 빛이 더 광범위 하 게 액세스할 수; 그러나, UV 소스 범위에 커플링 하 고 그들은 여전히 유도 색수차를 다루는 대부분 사용자3,,616에 상당한 도전을 제시. UV 높은 만들 수 있는 능력에 초점을 맞춘 UV 염료 광학 초점의 수는 1990 년대 내내 인기에서 증가 하 고 캡처 UV 흥분 형광 되었다 더 광범위 하 게 사용할 수 있는16, 사용자가 제공 하는 레이저 스캐닝에서 개선 여기 셀6,17내 명소. 그러나, 그것이 2000 년대 초반까지 수많은 보고서와에 sensitizers 없이 DNA 가닥 나누기 유도 될 수 있는 시연 등장 때 높은 강도 레이저와 밀접 하 게 집중 된 광속의이 조합은의 진정한 영향 생각 했다는 UV-A 범위6,10,18,,1920, 405 nm21,22,,2324, 25,26, 488 nm27처럼 더 이상 보이는 파장에도. 이러한 발전은 다양 한 상업 시스템에 마이크로-방사선 조사 기술의 더 광범위 하 게 채택에 대 한 허용. 이러한 개발 병행, 2 광자 기술 또한 등장 DNA 손상;의 정확한 유도 허용 이러한 진보는 여기 논의 될 것입니다, 하지만이 방법론9,,2829,30논의 검토 기사 수가 있다.
Confocal 현미경 매우 집중된 UV 빛 및 DNA 수 선 단백질의 실시간 추적을 허용 하도록 형광 단백질의 대폭적인 가용성의 수의 현재 접근와 마이크로-방사선 조사 기술 진화 DNA 손상 응답 및 복구 경로 조사 하기 위한 강력한 도구. 그러나, 사용자는 DNA 손상의 세대는 매우 레이저 파장 및 하위 핵 영역에 적용 하는 파워에 의존 해야 합니다. UV-C의 사용 (~ 260 nm) 직접 DNA 여기 및 UV photoproducts7,8의 유도 대 한 높은 선택도 허용 하는 파장. 자외선-B와 자외선 A 파장이 DNA 손상 (기본 병 변, SSBs, 및 DSBs)의 혼합물을 생성, 적용 능력과 세포 배경에 따라 활용7. 타겟된 세포에 산화 수준과 생 photosensitizers이이 파장을 제작한 DNA 손상 혼합물을 좌우할 수 있다. 또한, 외 인 photosensitizers (BrdU, 등)를 사용 하 여 DNA 손상의 유도에 필요한 에너지를 낮추는에 도움이 수 있습니다. 그러나, 이러한 에이전트 스스로, DNA 손상을 일으킬 수 있다 그리고 그들의 사용 사용자가 고려해 야 하는 원치 않는 효과 생산할 수 있습니다 그래서 세포 주기 및 염색 질 구조를 변경할 수 있습니다 그들은. 따라서, 마이크로-방사선 조사를 사용 하 여 DNA 손상 응답 및 수리 공부를 하기 전에 관심, 사용, 사용할 수 있는 파장 그리고 만든 DNA 손상 혼합의 DNA 수 선 통로의 신중한 고려가 필요 합니다.
여기, 레이저 마이크로-방사선 두 가지 일반적으로 사용 되 파장, 355에서 수행 됩니다 및 405 nm,이 파장 및 이러한 손상 혼합물의 수리 검토에 영향에 의해 유도 된 DNA 손상의 혼합물을 보여 sensitizers 없이SSBs 및 DSBs. 사용자는이 파장 스트랜드 나누기 또는 기본 병 변의 단일 종 생성 하지 않는 알고 있어야 합니다. DNA 복구 경로 구분 하기 위해 사용자는 핵의 특정 영역에 적용 된 파워 제어 고 여러 가닥 휴식 마커 및 DNA 병 변 항 체를 사용 하 여 유도 된 손상 특성화 신중 하 게 해야 합니다. 제대로 적용을 특징 레이저 마이크로-방사선 DNA 손상으로 일부 기본 병 변 및 SSBs 또는 DSBs, 수리를 평가 하기 위해 사용자의 일부 수 종을 풍요롭게 수 있습니다. 따라서, 우리 사용자가 reproducibly 레이저 마이크로-방사선 조사를 수행, 적용 된 레이저 복용량에 의해 유도 된 DNA 손상 혼합물의 특성 및 데이터 분석을 수행 하는 방법을 제공.

<table><tbody><tr><td>Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm laser</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>Radiation source</td></tr><tr><td>Galvanometer photoactivation miniscanner</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide photodiode power sensor</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>Fiber photodiode power sensor</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>Digital handheld optical power and energy meter</td><td>THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td></tr><tr><td>Minimal essential media</td><td>Hyclone</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus transfection</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4 chambered coverglass</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8 chambered coverglass</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone H2AX&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td><td>Cosmo Bio clone</td><td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti 8-oxo-2&amp;acute;-deoxyguanosine&amp;nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 goat anti-mouse</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 goat anti-rabbit</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>Caution toxic!</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>Caution toxic!</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>Caution toxic!</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Caution toxic!</td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Amresco</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

높은 조정된 DNA 복구 경로 검색, 소비 세 및 손상 된 DNA 기초, 대체 및 DNA 가닥 나누기의 복구를 조정 존재 한다. 분자 생물학 기술 구조, 효소 기능 및 복구 단백질의 활동을 명확히 해야, 하는 동안 아직도 어떻게 수리는 핵 내에서 조정 필요가 하다. 레이저 마이크로-방사선 DNA 손상 유도 및 복구 단백질의 신규 모집을 모니터링을 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 레이저 마이크로-방사선에 의해 DNA 손상을 유도 파장의 범위와 함께 발생할 수 있으며 사용자가 안정적으로 단일 가닥 나누기, 기본 병 변 및 복용량의 범위와 이중 가닥 나누기를 일으킬 수 있다. 여기, 레이저 마이크로-방사선 조사 선 단일 및 이중 가닥 나누기 두 일반적인 confocal 레이저 파장, 355에 의해 유도 된 검사는 nm, 405 nm. 사용자 reproducibly 레이저 마이크로 조사 데이터 수집 및 분석을 수행할 수 있도록 유도 하는 특정 손상 혼합물에 적용 된 레이저 복용량의 추가, 적절 한 특성 설명 되어 있습니다.

유도 된 DNA 손상의 특성 기본 병 변 및 스트랜드 나누기의 유도 선택한 핵 영역에 적용 된 레이저 복용량에 따라 달라 집니다 그리고 셀 모델의 휴대폰 microenvironment 사용7. 형광 단백질 융합 단백질 XRCC1, 53BP1, Ku70, 또는 Rad51 같은 복구, 제공 하는 유용한 단일 및 이중 가닥 손상 ROI 위의 내 형광 단백질의 축적을 참조 하는 데 필요한 최소한의 에너지를 설정 하기 위한 휴식 마커는 배경 형광9,,1931. 응답을 유도 하는 조건이 발견 되 면 그 특정 파장 및 복용량에 의해 유도 된 손상 혼합물의 특성에 중대 하다. 복용량과 기간 사용 하는 파장에서의 감쇠는 복잡 한 피해 혼합물의 형성을 최소화 하기 위해 사용자를 허용할 수 있습니다. UV-A 범위에서 낮은 레이저 복용량 SSBs와 작은 양의 기본 병 변, SSBR 및 BER 경로10,28공부에 대 한 적절 한 주로 생산 증명 있다. 복용량을 증가 더 복잡 한 기본 병 변, 산화 만들고 UV 유도, 그리고 DSBs7,10의 더 큰 숫자를 유도 합니다. 단일 종의 DNA 손상의 유도 특정 DNA 수 선 통로의 검사에 대 한 바람직한, 사용자 기본 병 변 또는 DSBs 보다 훨씬 더 자주 되 고 SSBs 같은 특정 병 변으로 DNA 변의 혼합 유도 더 가능성이 높습니다. 과산화 수소 (H2O2) 또는 메 틸 methanesulfonate (MM)32같은 화학 약품에 의해 유도 된 DNA 손상 혼합물와 비슷합니다. 사용자가 때 그들은 혼합물을 손상 결과 발생할 수 있습니다, 그리고 복용량 및 유도 피해 사이트에서 병 변 주의 특성화 comparability 그들의 결과의 재현성을 보장 하는 데 필요한 보고를 해야 합니다.
마이크로 조사 연구에서 XRCC1 GFP 기본 병 변 및 SSBs9,28의 유도 대 한 표식으로 종종 사용 됩니다. XRCC1 SSB 복구 (SSBR)에서 중요 한 역할을 하는 비 계 단백질 이며 기본 절단 (BER)를 수리 하 고 또한 뉴클레오티드 절단 복구 (NER)33,34,35 같은 다른 복구 경로에 참여 . 그것은 중요 한 역할 조정 poly(ADP-ribose) 중 합 효소 1 (PARP-1), DNA 중 합 효소 β를 포함 한 주요 단백질의 수와 상호 작용 하는 DNA 수리에서 (Pol β), 그리고 DNA 리가 III. 우리가 활용 XRCC1-GFP 안정적 조 K1 셀에 표현 SSBs DSBs 생성 하는 데 필요한 레이저 복용량을 결정. 우리는 먼저 각 파장 (그림 1)에 대 한 XRCC1 GFP의 관찰 채용을 유도 하는 데 필요한 최소 복용량을 식별. 355 nm 파장에 대 한 정의 손상 이상의 2 s 면만 시간 투자 수익 생성 배경 (그림 1A) 감지 했다 DNA 손상의 유도 나타내는 그 투자 수익 내 증가 형광 신호. 405에 대 한 nm, 8 fps 스캔 속도 ROI (그림 1A) 손상에 현저한 모집을 생성 하기 위해 필요 했다. 복용량 증가 다음 (10 s 355 nm을 405에 대 한 0.5 fps nm) 더 강렬한 만들려고 ROI (그림 1A) 손상.
모집 및 XRCC1-GFP 유발된 손상의 사이트에서의 보존 되었다 다음 timelapse 이미징에 의해 모니터링 됩니다. DNA 손상의 사이트에서 단백질의 보존 유발된 손상의 사이트에서 단백질의 분리는 종종 BER 또는 SSBR 완료에 대 한 마커를 간주가 DNA 수리를 나타낼 수 있습니다. 그러나, 명확한 증거가 수리의 완료와 함께 레이저 유도 DNA 손상 사이트에서 XRCC1의 분리를 연결 되었습니다. 손상의 사이트에 단백질의 신규 모집 의미 형광 신호 전체 핵 (그림 1B)에 대 한 측정을 통해 손상 된 투자 수익을 내는 형광 신호의 평균 강도 보고 하 여 측정 됩니다. 이 유형의 정규화 다른 정규화 기술 관심사의 단백질의 세포 분포에 따라 사용할 수 있지만 주소 강도 변동 핵 신호에 도움이 됩니다. 여기, 그래서 핵 영역에 정규화 측정 신호 손상 ROI 재배포 XRCC1 핵 구획, 지역화 됩니다. 투자 수익 평균 형광 강도 다음 사전 손상 이미지를 포함 하 고 시간 (그림 1C)의 함수로 그래프로 timelapse의 각 이미지에 대 한 기록 됩니다.
우리 다음 추가 특징 DNA 기본 병 변 형성 검사 두 선택한 레이저 복용량에 의해 유도 된 손상. 첫째, 일일, 부피가 UV 유도 된 병 변의 형성 NER 종류 병 변 (그림 2A)에 대 한 표식으로 면역 형광 검사에 의해 조사 되었다. 다음, oxidatively 유도 기본 lesion8 oxodG BER 유형 병 변 (그림 2B)에 대 한 표식으로 조사 했다. 일일 병 변에서 크게 증가 두 파장에 대 한 낮은 복용량 노출에서 관찰 되었다 (2 355 nm와 405에 대 한 8 fps에 대 한 s nm), 높은 복용량 두 파장에서 처리 하는 동안 (10 355 nm, 405에 대 한 0.5 fps에 대 한 s nm) 형광에 상당한 증가 보여주었다 신호 손상 ROI (그림 2A) 내에서 관찰. 각 손상 된 셀 쇼가 손상 형성 및 파장에 복용량, 일일 병 변의 저수준 더 낮은 복용량에 있을 수 있지만 부하 크게 되지 않을 수 있습니다 나타내는 탐지에 대 한 강도 의미 하는 일일 투자 수익의 점도 더 높은 복용량 적용 됩니다 때까지 발견 했습니다. scatterplot 또한 손상 혼합물의 정확한 정량화를 제한할 수는 항 체 탐지의 그 비효율성을 제안 합니다.
이것은 더 마커 8-oxodG에 의해 oxidatively 유발 DNA 변의 탐지에 강조 된다. 피해 내 형광 신호에 명확한 증가 투자 수익 8-oxodG 레이저 파장 또는 복용량 사용 (그림 2B)에 대 한 관찰 되었다. 이 작품에 사용 되는 항 체는 이전 간행물9,,1036;와 일치 그러나, 그것은 8-oxodG 항 체37,38와 형성을 관찰에 제한이 있을 수 있습니다 주목 해야한다. Oxidatively 유도 장애의 부족의 확인은 또한 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), 효소 DNA10에서 8 oxodG의 제거에 대 한 책임의 모집 같은 두 번째 표식에 의해 권장 됩니다. 우리가 우리의 DNA 손상 사이트; OGG1 모집을 준수 하지 않았다 그러나, oxidatively 유도 DNA 손상의 저급의 형성 수 없습니다 배제할 수 완전히.
마지막으로, 우리는 정도에서 53BP 1, γH2AX 및 2 개의 마커를 사용 하 여 하는 DSBs 형성 검사면역 형광 검사에 의해 d 레이저 복용량 (그림 3 &#38; 4). ΓH2AX 일반적으로 스트랜드 휴식 마커로 사용 하지만 DSBs에 대 한 그것의 구체적 보고서39,40수에 조사 되어 있다. 또한, 지역화 가닥 틈에 신호의 제한 때문에이 신호 전파 수 가닥 휴식 사이트에서 전파 되는 인 산화 이벤트입니다. 따라서, 53BP-1와 γH2AX를 결합 수 있습니다 손상 투자 수익 내 DSB 형성의 더 정확한 평가.
ΓH2AX과 53BP-1의 마이크로 조사에 응답은 파장 복용량 의존. 낮은 복용량 (2 s) 자극에 355 nm 5, 20 분, 그리고 모두 표시에 대 한 약한 및 가변 응답 10 분 게시물 방사선(그림 3)에서 응답을 elicits. 높은 복용량 (10 s) 355 nm 마이크로-방사선의 5, 10, 및 (그림 3B) 40 분 감소는 20 분 게시물 방사선 손상 ROI 내의 증가 형광 신호를 유도 한다. 이러한 결과 초기 시간 포인트에서 이중 가닥 휴식 마커 γH2AX의 감소 감지에 의해 증명으로 355 nm 복용량의 적정 수리 통로의 상호 자극을 최소화 하기 위해 필요한 주의 표시 (&#60; 20 분) 낮은 복용량에서 적용.
비슷한 실험은 모두 낮은 (8 fps)와 높은 복용량 (0.5 fps) 405 nm 레이저 자극 (그림 4)를 사용 하 여 수행 했다. 이 파장에서 형광 강도 피해 ROI 내에서 상당한 축적 53BP-1와 γH2AX 적용 된 복용량,이 복용이 생성 거의 단일 및 이중 가닥 나누기의 복잡 한 혼합물을 나타내는에 대 한 관찰 DNA 손상 (그림 4)의 유도 후 즉시. 또한, 405 nm 쇼 팬 핵 γH2AX 얼룩이 손상 유도 (그림 4B, 아래)의 10 분 이내에 증가의 고용량을 어려운 손상 투자 수익의 검색 53BP 1 축적 하는 동안 보고서를 더 피해 투자 수익에 포함.
이러한 결과 405 nm 마이크로-방사선 모니터링 SSBR 또는 BER, 적합 하지 않습니다 그리고 그 여러 DNA adducts 표식과 휴식 물가 완전히 유발된 병 변 및 DNA 복구 응답 특성을 고용 한다 명확 하 게 보여줍니다.
모집 및 XRCC1 GFP의 보존에 복용량 의존 변경 일단 유발된 DNA 손상, 성격 레이저 마이크로-방사선 DNA 수 선 단백질의 역학을 공부 하기 위한 이상적인 플랫폼을 수 있습니다. XRCC1 GFP의 보존 및 분리 활동은 예기치 않은 다른 손상 혼합물의 유도 각 파장에 의해 주어진 복용량 종속성 (그림 1)를 보여 줍니다. 높은 방사선 복용량 (10 s와 0.5 fps) 더 낮은 복용량에 상대적인 XRCC1 GFP의 높은 강도 모집 및 손상의 사이트에서 XRCC1 GFP의 더 긴 보존 20 분 시간 과정 (그림 1C) 표시합니다. 355와 405 nm에 대 한 더 높은 복용량에서 만든 DNA 손상 임을 나타냅니다 가능성이 모양과 DSB 마커, γH2AX 및 53BP-1의 유지와 일치 하는 실험의 과정에서 해결 되지 않은 (그림 3 &#38; 4 ).
흥미롭게도, 손상의 더 낮은 복용량 (2 s와 8 fps) 표시 XRCC1-GFP 피해 사이트의 신속한 채용 및 사전 조사 수준 (그림 1C) 실험 시간에 걸쳐 XRCC1 GFP의 분리. 손상 혼합물의 완전 한 특성 없이이 결론 SSBs 및 기본 병 변은 완전히 해결 한다는 이러한 손상 조건을 사용 하 여 발생할 수 있습니다. 그러나, γH2AX 및 53BP-355 위한 40 분에서 1 nm 405에 대 일 분에 nm는 다른 해석으로 이어질 수 있습니다. 355 nm 2의 복용량에 대 한 피해 혼합물 수 주로 SSBs, 있으므로 일부 배달된 병 변 DSBs 선도 수 있습니다 또는 DSBs이이 에너지에 의해 생성 된 더 긴 시간 규모에 수리는 40 분에서 DSB 마커 모양을 나타낼 수 있습니다. 시간 규모 차이 SSBR DSB 수리 이전에 보고 된28,,4142되었습니다. 마찬가지로, 405 nm 낮은 복용량 (8 fps) 분리 SSBs의 낮은 수준을 나타낼 수 있습니다 또는 에이전트 손상 마이크로 조사와 다른 DNA 손상 한 클러스터링 SSBs DSBs, 신속 하 게 변환 되는의이 대 한 언급 되었습니다 이전43, 44 , 45.
함께 특성화 유도 손상 혼합물의 중요성을 강조 하는이 결과 고 단백질 복구 여러 DNA를 이용 하 여 모집 및 DNA의 보존을 해석 하기 위한 마커 단백질 유도 손상의 사이트에 복구.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
그림 1 . 레이저 마이크로-방사선 유도 XRCC1 GFP 모집 합니다.  (A) 조-K1 셀 XRCC1 GFP를 표현 안정적으로 반구 되었고 전후 즉시 손상 유도 몇 군데. 화살표 표시 마이크로 방사선 복용량의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. (B) 모집 손상 ROI 내의 평균 형광 강도 결정 하 고 전체 핵의 평균 형광 강도를 정상화 하 여 측정 됩니다. 각 timelapse 이미지 (C) 신규 모집의 역학을 측정할 수 있습니다. 그래프는 두 개의 독립적인 실험 SEM를 나타내는 오차 막대를 (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
그림 2 . 레이저 마이크로-방사선 뉴클레오티드 손상을 유도합니다.  조-K1 셀 레이저 마이크로 조사를 받게 되었고 손상 유도 후 즉시 고정. 면역 형광 검사 일일 검색을 수행 하 고 8 oxodG adducts. (A) 가기, 점도 투자 수익 평균 형광 강렬에서 관찰의 일일 비용 얼룩 후 세포 손상. 하단, 일일 얼룩의 대표 이미지입니다. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m (n = 12). (8-oxodG 얼룩에 대 한 B) 대표 이미지. 화살표마이크로-방사선의 위치를 표시 하 고 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
그림 3 . DNA 이중 가닥 휴식 마커 복용량 의존 방식에서 355 nm 마이크로 조사에 응답.  조-K1 셀 마이크로 조사를 받게 되었고 시간 포인트 표시 후 자극에 고정. DSB 마커 γH2AX 및 53BP-1에 대 한 면역 형광 검사 수행 되었다. (A) 정규화 된 손상 손상 및 손상 된 세포에 대 한 형광 강렬 측정을 의미 하는 투자 수익의 음모를 피해 라. 오차 막대는 SEM의 대표 (n = 12). (ΓH2AX 및 53BP-1 얼룩 B) 대표 이미지. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
그림 4. DNA 이중 가닥 휴식 마커 튼튼하게 405 nm 마이크로 조사에 응답. 조-K1 셀 마이크로 조사를 받게 되었고 시간 포인트 표시 된 게시물 자극에 고정. DSB 마커 γH2AX 및 53BP-1에 대 한 면역 형광. (A) 정규화 된 손상 손상 및 손상 된 세포에 대 한 형광 강렬 측정을 의미 하는 투자 수익의 음모를 피해 라. 오차 막대는 SEM의 대표 (n = 12). (ΓH2AX 및 53BP-1 얼룩 B) 대표 이미지. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.7K 조회수.  University of South Alabama Mitchell Cancer Institute. 공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

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Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

연구

유전학

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

암 연구학

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

유방암 센티넬 노드 생검에 있는 단 하나 기술로 1% 메틸렌 청색염의 응용

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

생물학

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Immunofluorescence Microscopy for the Analysis of DNA Double-Strand Breaks

Prepare two cytospins with mononuclear cells of the patient samples by centrifugation of 1 x 105 cells for each preparation. Fix the cells with 200 microliters of 4% PFA for 10 minutes.
After fixation, wash the cells gently three times with 30 milliliters of PBS for five minutes each on a shaker. Then, permeabilize the cells with 200 microliters of 0.1% Octoxinol-9 for 10 minutes. Wash the cells gently three times with 30 milliliters of 5% blocking solution for five minutes each on a lab shaker. Block the cells in 30 milliliters of fresh 5% blocking solution for one hour.
The fixation and permeabilization of the cells with 4% paraformaldehyde and 0.1% Octoxinol-9 preserved the gamma H2AX and 53BP1 foci distinctly.
Incubate one preparation of the cells with a mouse monoclonal anti-gamma H2AX antibody and the other preparation of the cells with a mouse monoclonal anti-gamma H2AX antibody and a polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody overnight at 4 degrees Celsius.
The use of proven anti-gamma H2AX and anti-53BP1 antibodies is highly recommended.
After incubation, wash the cells gently three times with 30 milliliters of 2% blocking solution for each five minutes on a lab shaker.
Next, incubate the first preparation of the cells with an Alexa488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody diluted 1 in 500 in 2% blocking solution. Incubate the second preparation of the cells with an Alexa488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody and an Alexa555-conjugated donkey anti-rabbit secondary antibody diluted 1 in 500 in 2% blocking solution.
Wash the cells gently three times with 30 milliliters of PBS on a laboratory shaker. Remove the PBS and mount the cells with mounting medium. Cautiously, put a coverslip on top of the mounting medium, so that no air bubbles are embedded. Wait at least three hours for the mounting medium to harden before analyzing the cells by fluorescence microscopy.
Finally, analyze the gamma H2AX and 53BP1 foci in the cell nuclei with a fluorescence microscope equipped with filters for DAPI, Alexa488, and Cy3 during imaging at a 100x objective magnification.