이 연구는 (Z01 AG000746-08)와 판 코니 빈혈 연구 기금을 노화에 국립 보건원, 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.

파기 TMP-1의 제조 <ol><li> 50 mg의 (0.18 밀리몰) 8- trimethylpsoralen 4&#39;- 클로로 -4,5- &#39;및 건식 25 ㎖ 둥근 590 mg의 (2.7 밀리몰) 4,7,10- 트리 옥사 1,13-tridecanedi 아민의 믹스 질소하에 플라스크 -bottom. 12 시간 동안 톨루엔 10ml를 첨가하고 환류를 추가한다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다. <ol><li> 실리카겔상에서 플래시 칼럼 크로마토 그래피시킴으로써 잔류 물을 정제 하였다. (1 : 0.5 ~ 9), 클로로포름, 메탄올, 28 % 암모니아 용액으로 컬럼을 용출시켰다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 증발시키고, 회복 순수 -4 &#39;- [N- (13- 아미노 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 메틸 4,5&#39;, 8- trimethylpsoralen 점성의 담황색 액체. </li><li> 4 5.5 밀리그램 (0.012 밀리몰)을 혼합 &#39;- [N-를 (13- 아미노 - 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 -4,5-&#39;디곡 NHS 에스테르 5 ㎎ (0.008 밀리몰)의 8-trimethylpsoralen 질소하에 무수 환저 플라스크. 0.5 mL의 무수 디메틸 포름 아미드를 추가 (DMF)를디 트리메틸 3.4 μL와 18 시간 동안 50 ℃에서 교반 하였다. </li><li> 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다. </li><li> 디클로로 메탄 최소량 잔사를 용해. 가로 정지상으로서 실리카겔 분취 박층 판의 하단에 2 μL 스폿의 용액을 적용한다. 메탄올 : 클로로포름에 취용 TLC를 실행하여, 28 % 수산화 암모늄 (8 : 1 : 0.1). </li><li> 수직 에지를 제외한 판 마스크 단파장 UV 254 nm의 램프 제품의 대역을 식별한다. 주걱 플레이트로부터 생성물을 긁어 클로로포름하여 순수한 생성물을 분리 : 메탄올 : 28 % 수산화 암모늄 (8 : 1 : 0.1) 혼합물. </li><li> 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다. 50 % EtOH로 1 mL의 잔류 펠렛을 녹이고 : H 2 O, 모든 용매 (~ 3 시간), 증발 될 때까지 원심 증발기에 1.5 ㎖의 튜브 (~ 20 개 씩) 건조 50 μL 분취 액으로 분배. </li><li>원심 증발기에서 다시 H 2 O 건조 : 50 %의 EtOH 200 μL의 각 분취 액을 재용. 50 %의 EtOH에 200 μL 분취를 각각 다시 녹이고 : H 2 O, 장기 저장을 위해 -20 ℃에서 원심 증발기 저장 펠렛 건조. </li></ol></li><li> H 2 O가 1 준비 : H 2 O에 녹인 파기 TMP-100 희석하고 250 nm에서 OD를 측정하는 용도의 경우, 50 %의 EtOH 50 μL의 펠릿을 용해. 파기-TMP의 흡광 계수는 25000이다. -20 ° C에 저장하는 경우이 솔루션은 약 한 달 동안 안정하다. 각각의 사용 이전에 250 nm에서의 OD를 측정하여 농도를 확인한다. <ol><li> 스톡 농도를 계산 : ABS × 100 X10 (μM)에서 6 / 25,000 = 농도. 일반적으로 원액은 약 3 mm이다. 이 배지에 첨가의 EtOH 부피를 최소화하기 위해이 범위 인 것이 중요하다. </li></ol></li></ol> 2. 레이저 지역화 파고-TMP ICLS <ol><li> 체육SRS 질소 레이저 (337 ㎚)와 공 초점 현미경 rform 레이저 제이션 365 nm의 라인 발광 0.7 NW의 파워로, 10 Hz에서 3 개 ns의 펄스를 발사 염료 셀을 통해 펌핑. </li><li> 35 밀리미터 유리의면에 수직 마크를 확인은 마킹 펜으로 세포 배양 접시를 바닥. 다이아몬드 펜 배양 표면에 유리의 중앙에서 교차 스크래치 등 접시 측의 블랙 스트라이프를 크로스 한 팔의 상단에있다. 이것은 상기 셀들이 동일한 초점 평면에있을 수 있도록 교차는 유리의 성장 표면 상에 표시된다. </li><li> 70 %의 EtOH 린스와 함께 마킹 후에 멸균 접시. 세포를 도금하기 전에 건조. </li><li> 십자가에서 플레이트 세포 (예 : 헬라 또는 U2OS 표준 실험실 균주)은 하나 또는 두 개의 일전 문화 요리를 표시했다. 셀 적극적으로 나누어 실험 당일 50-70% 합류한다. 균일 라벨 DNA 1 μM 5- 클로로 -2- 데 옥시 우리 딘 (CldU)로 24 시간 동안 인큐베이션. </li><li> 더하다50 % EtOH를 발굴-TMP : 20 μM의 최종 농도까지 세포 배양 배지에 H 2 O. 37 ℃로 매체를 준비한다. 배양기에서 세포 도처 변경 매체 (37 ° C를 5 % CO 2) 30 분 발굴-TMP가 평형을 허용 할. </li><li> 세포가 배양하는 동안, 레이저 활성 인 시야의 X / Y 좌표를 확립한다. 레이저는 수평 및 대각선을 따라 미러 슬라이드 유리를 에칭하기 위해 소프트웨어에 의해 지시 된 제조자의 보정 절차를 수행. 두 라인은 레이저가 표적을 공격 할 수있는 필드의 경계를 정의합니다. </li><li> 현미경 스테이지 제어 CO 2 및 습도와 37 ℃의 환경 챔버 내의 플레이트를 놓고, 십자가의 교차점에 오일 60X 대물 포커스. </li><li> 소프트웨어의 형상 도구 연구자에 의해 설립 된 ROI에 365 nm의 레이저 빔을 지향, 3의 스트라이프를 형성# 181 0.6 μm의 MX. 투자 수익 (ROI)의 개요는 십자가의 교차로 바로 근처에있는 세포의 핵에 커서가 배치됩니다. 핵을 통해 레이저 중도를 타겟팅 Z 초점 평면을 조정한다. 350-370 nm 범위의 레이저를 사용합니다. 405 nm의 레이저는 크로스 링크 (19)를 유도 할 수 없다. 참고 : 우리는 미분 간섭 대비 (DIC) 이미징 핵질 구별 할 수있는 핵소체, 외부 nucleoplasmic 분야에서 투자 수익 (ROI)을 찾습니다. </li><li> 셀 (셀 어둡게 한 후 사라진다) 말살 충분한 레벨로 전력 설정을 증가시켜 레이저의 초점과 활동을 확인한다. 이 현미경을 통해 다음 coverslip을 통해 세포에 레이저에 대한 방해받지 않고 빛의 경로에 대한 중요한 진단이다. <ol><li> 소 랄렌과 ICL 유도 DDR (이 각 레이저 / 마이크에 대한 경험적으로 결정되어야합니다 활성화에가 충분한 전원 설정을 낮 춥니 다roscope 조합). (γ-H2AX의 형성에 의해 모니터링) 소 랄렌의 부재에 DDR을 활성화하지 않는 레이저 강도 설정 (현재 1.7 %)를 사용합니다. 주 :이 중요한 결정하고 레이저 광원 또는 광 경로의 구성 요소가 변경되는 경우의 설정 조정이 필요할 수있다. GFP 축적이 레이저 랄렌 줄무늬 그러한 빠르게 (초) 모집 둘 또는 XPC FAN1 같은 복구 단백질 태그 따르되 형 레이저에 노출 ROI하지. 몇 분은 다른 사람을 위해 필요할 수 있습니다 동안 DDR의 일부 단백질, 초 이내에 나타납니다. 관심 각각의 단백질을 시간 코스 결정을 수행하는 것이 필요하다. 우리는 또한 레이저에 노출되지 않은 세포에서 응답 단백질의 더 줄무늬가 없음을 확인합니다. </li></ol></li><li> 필드에있는 모든 세포는 십자가의 교차로에 가까운 체류, 이동에 새로운 필드 플레이트를 대상으로 한 후. </li><li> 실험에서 determ하도록 설계병변 간 거리의 분포가 교차 20-25 필드 (4-5 세포 / 필드)에 레이저에 세포를 노출 Ine입니다. 지역화 ICLS 근방에 복제 패턴을 분석하기 위해 레이저 발사 후 10 μM 5- 요오도 -2- 데 옥시 우리 딘 (IDU)와 함께 세포를 배양한다. 참고 : IDU와 배양 시간은 다소 임의적이다. 우리는 20 분으로 짧고 긴 60 분 (아래 참조)로 사용 하였다. 긴 펄스 (몇 시간)는 종종 이렇게 이미지에 단일 포크의 진행을 수있는 기회를 잃고, 유착 여러 복제 책자 초래한다. 일부 실험에서, CES는 복제 소책자 펄스 라벨링 하였다 파기-TMP에 노출하기 전에 라벨 DNA로 균일를 24 시간 동안 CldU으로 표시된다. </li></ol> 3. 세포 수확 및 DNA 섬유의 연신 <ol><li> 스테이지에서 플레이트를 제거하고 배지를 제거하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척한다. PBS를 솔루션을 제거합니다. 상업 트립신의 10 μL 드롭 배치/ 유리 표면의 중앙에서의 교차의 교차점에 EDTA 용액. </li><li> 실온 (RT)에서 3-4 분 동안 인큐베이션 한 후 피펫 팁으로 분리 된 세포를 트립신 용액을 그린다. 트립신을 중화 할 필요가 없습니다. </li><li> 실란 처리 유리 현미경 슬라이드의 일단의 세포를 트립신 / EDTA의 드롭을 배치. 를 Lyse 균체 및 건조 할 수있는 풀의 주변부를 허용 0.5 % SDS 용액 10 μL를 첨가하여 DNA를 분리하고, 피펫 끝으로 부드럽게 혼합을 실온에서 3-4 분 동안 배양한다. </li><li> 슬라이드를 기울 20º 액체가 아래로 끝까지 실행할 수 있습니다. DNA는 섬유를 흐르는 액체의 유체 역학적 힘에 의해 연신 / 확장된다. 프레젠테이션 건조 공기 (~ 10 분)하자 3 FIX : 10 분 동안 1 메탄올 / 아세트산. 다시 수정 솔루션 및 건조 공기에서 슬라이드를 제거합니다. 이때 이들은 -20 ° C에서 70 %의 EtOH에 무기한 저장 될 수있다. 70 %의 EtOH로에서 제거에 NE 전에 공기 건조하도록 허용XT 단계. </li><li> PBS에서 슬라이드를 세척 한 후 실온에서 1 시간 동안 2.5 M 염산으로 변성. 이 치료는 DNA 항체에 통합 된 할로겐화 핵산 염기 액세스 할 수 있도록 depurinates. </li><li> 0.4 M 트리스 -HCl, pH 7.4의 슬라이드 중화. PBS로 두 번 씻어 / 0.5 % 트윈 20 (PBST)을 5 분마다. </li><li> 블록 PBS에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 10 %의 염소 혈청 슬라이드. 슬라이드 고르게 블로킹 용액을 확산하고 RT에서 1 시간 동안 배양하는 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버. </li><li> 1 μL 피펫 100 : 마우스 항 - 브로 모데 옥시 우리 딘의 차단 용액 200 희석 각 슬라이드에 1 차 항체 (특히 CldU를 검출한다). RT에서 1 시간 동안 습윤 챔버에 슬라이드 위에 고르게 희석 확산 배양하는 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버. 파라 필름을 제거하고 5 분마다 슬라이드를 PBST에 세 번 씻는다. </li><li> 각 슬라이드 차단 용액에 (100 1) 염소 항 - 쥐 알렉사 형석 647 희석의 100 μL 피펫. 커버파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 및 RT에서 45 분 동안 배양한다. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오. </li><li> 200 : 희석 (1시 40분) 마우스 항 브로 모데 옥시 우리 딘의 피펫 100 μL 일차 항체 및 토끼 항 DIG 항체 (1 (. LDU 및 CldU이 이중 특이성 래트 종래 배양에서 항 BrdU에 의해 CldU의 차단을 필요로 검출) ) 각 슬라이드 용액을 차단한다. 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버와 RT에서 1 시간 동안 습윤 챔버에서 배양한다. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오. </li><li> 각 슬라이드 차단 용액에 염소 항 - 토끼 프로브 (예 Qdot 655) (: 100 1) 염소 항 - 마우스 알렉사 488 andc 형석 (5000 1) 희석의 100 μL 피펫. 부드럽게 파라 필름과 슬라이드를 덮고 실온에서 45 분 동안 품어. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오. </li><li> 종이 타월로 여분의 PBST를 배출합니다. 각 슬라이드에 장착 antifade 매체의 50 μL를 추가하고, 커버 슬립으로 덮고. 이미지 또는 저장소-20 ° C에서 더 이상 48 이상의 시간. </li></ol> 형광 현미경 4. 섬유 이미징 <ol><li> FITC, Cy5에 도트와 Q (655)와 연결된 감지 완전히 동력 필터 휠 거꾸로 현미경에 63X 대물 렌즈를 통해 이미지 획득을 수행한다. 상기 여기 필터는 425 ㎚이며, 배출 필터는 발광 피크 (20)를 중심으로 20 개 내지 655 ㎚이다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

레이저 현지화 기술은 밝은 필드 현미경에서 볼 수 있습니다 핵에 부착 세포의 사용을 필요로한다. 우리는 리신 또는 콜라겐, 또는 더 복잡한 혼합물로서 세포 접착 제제로 유리 표면에, 예컨대 차 림프구 또는 AD293 느슨하게 접착 배양 된 세포와 같은 비 접착 성 세포를 부착하는 것을 시도했다. 이러한 치료는 표면에 세포를 결합 할 수 있지만, 우리는 그들이 일반적으로 매우 어려운 핵에 집중하...

DNA는 또한,도 산화 적 대사에 의해 생성 된 내인성 라디칼 종에 의해 공격 등의 방사선, 자외선, 환경 독소, 연소 생성물과 같은 외래 에이전트로부터 일정한 공격을 받고있다. 이 모든 화학적 또는 물리적으로 DNA 1의 무결성을 방해 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 게놈의 교란은 병변 수리에 관여하는 단백질과 마이크로 RNA하지 않을 경우 수천, 수백와 DNA 손상 응답 (DDR), 모집 및 사후 번역 수정 캐스케이드를 활성화 할 수 있습니다, 세포주기, 세포 사멸, 노화 및 염증 경로의 조절 2. 동독에 대한 우리의 정보의 대부분은 DSBs와 연구에서 비롯됩니다. 이는 3 살아있는 세포 게놈 DNA에서 서열 특이 나누기 포함 나누기를 도입하기위한 기술의 유용성에 큰 부분이다. 또한, propensit중단의 예는 면역에 의해 표시 될 수 DDR 단백질의 초점을 유도하는 단계, 및 반응 속도론 단백질의 요구를 식별하는 매우 유용하고있다. 동독 연구를위한 핵심 기술 중 하나는 살아있는 세포 4의 핵에 &#39;관심 지역&#39;에 DSBs의 스트라이프를 직접 (ROI)을 레이저 빔을 사용 보너와 동료에 의해 소개되었다. 실제로, 그들은 DDR의 단백질이 면역 식별 할 수있는 긴 초점을 만들었습니다. 이것은 레이저 노출 된 세포에서 인산화 된 히스톤 H2AX의 강한 스트라이프 (γ-H2AX) 그들의 증명에 의해 설명되었다. 이후 레이저 DSBs 접근법에 의해 유도되는 DDR의 다양한 연구에 이용되어왔다. 강력하고 인기 극적인 면역 형광 이미지의 소스 있지만,이 병변의 정체성에 대한 걱정없이, 관찰 결과를하기 위해 대부분의 실험에서 레이저 강도를 조절 주목해야한다밀도, 또는 간격. 사실, 이러한 추정을하기 어려울 수 있습니다. 따라서 그들은 주로 레이저 (5)에 의해 DNA에 도입 병변의 다양성에도 불구하고, 무시됩니다. 이 문헌 6에있는 많은 모순에 기여한다. DSBs는 대조적으로, 대부분의 DNA의 화학적 변형은 DDR 단백질 이산 초점의 형성을 자극하지 않는다. 이 병변 주파수의 우리의 현재 이해의 관점에서 중요하다. 인간 배양 세포는 S 단계 7, 8, 9 중 주로 형성된 세포주기 당 50 개 DSBs을 초래한다는 것이 추정된다. 적은 비 증식 세포에서 형성된다. 이것은 세포 / 1 일, 10 당 수만에있는 핵산 염기 손실 또는 수정 이벤트의 수와 대조를 이룬다. 따라서, 우리는 가장에 대해 알고비교적 드문 및 집계에서 훨씬 더 일반적이다 나선 왜곡 병변에 의해 유도 된 사람들에 대해 많은 작은 사건에 의해 유도 된 DDR. 게놈 DNA의 수정을 공유 결합하는 세포 반응에 대한 질문을 해결하기 위해, 우리는 고유의 DDR 유도 활동을했다 나선 왜곡 DNA 부가 물로 작업하고 싶었다. 또한, 실험 설계를 용이하게하고 해석 우리는 누구의 소개 시간에 대한 제어 및 시각화 의무가 있었다 될 수있는 구조에 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 소 랄렌에 기초한 전략을 개발했다. 현장에서 : Psoralens 잘 5 &#39;TA를 선호 광활성 DNA에 인터 칼을 특징으로한다. 질소 머스타드 및 마이 토마 이신 C (MMC)들은 장파장 UV (UVA) 광에 노출하지 않는 DNA 반응성 아닌 다른 가교제 달리. 인터 분자 나선 왜곡 interstrand 가교 결합을 생성하기 위해 반대 가닥의 티민 염기 (ICLS 반응) 11. 실험에 사용 된 트리메틸 랄렌 대부분의 제품은 형성되어 있지 않은 비교적 적은 monoadducts가 (10 % 미만) 생성 ICLS, 12, 한 가닥에 인접 염기 간의 intrastrand 가교이다. 그들은 시스 백금과 MMC 등의 복제와 전사, 소 랄렌 등의 가교제, 강력한 블록이기 때문에, 일반적으로 화학 요법에 사용됩니다. 따라서 랄렌 나선 구조의 왜곡으로 DDR의 활성화에 따라, 또한 임상 적 중요성이있는 화합물에 대한 세포 반응에 대한 통찰력을 제공 연구 할 수 있었다. 우리는 트리메틸 랄렌 (파기)를 디곡시 제닌에 링크시킨 시약을 합성 식물성 스테롤은 포유 동물 세포에서 발견 자주 immunotag으로 사용되지. photoactivation 대한 요구는 살아있는 세포의 핵에서 정의 된 ROI에 랄렌 ICLS의 레이저 광 (365 ㎚)으로 현지화를 허용한다. 이들은 IMM를 표시 할 수 있습니다발굴 태그에 대한 unofluorescence. DNA 수리 및 DDR 단백질 ICLS 13, 14 국소 레이저 스트라이프 나타났다. DSBs을 생산하는 데 사용 높은 레이저 강도에 의해 활성화 된 DDR 절연 또는 클러스터 손상 15, 16 때문일 수 있습니다. 따라서,이 실험 결과의 관련성 자연스럽게 병변 본 훨씬 낮은 농도로 발생하는 불확실하다. DNA의 소 랄렌 부가 주파수 및 간격에 대해 비슷한 질문을 해결하기 위해, 우리는 DNA 섬유 기술 17 immunoquantum 점을 이용했다. 양자점은 형광 염료보다 훨씬 더 밝은 빛에 노출 표백되지 않는다. 따라서 이들은 종종 단일 분자 이미징 (18)에 사용되는, 애플리케이션되는 형광 염료는 충분히 밝다. 개별 DNA 섬유 g에서 신장 될 수있다아가씨 슬라이드는 수확 셀에 앞서 배양 중에 혼입 클레오 사이드 유사체에 대해 면역 형광에 의해 표시 될 수있다. 우리는 땅을 파고 - 소 랄렌과 세포 치료 및 레이저 마이크로 조사에 대한 투자 수익 (ROI)을 노출. 섬유는 immunoquantum 점으로 가시화 될 수있는 셀의 개별 파기 랄렌 - 부가 물로부터 제조되었다. 상대적으로 짧은 시간 (20~60 분)에 대한 뉴 클레오 시드 유사체를 위해 세포를 노출시키는 레이저 국소 ICLS 근방 복제 책자의 표시를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flass glass column 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>With Volocity Software</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&amp;nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>with a Nitrogen pulsed laser&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dye cell</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 dye</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>New Comer Supply</td><td>Part # 5070</td><td>New Silane Slides</td></tr><tr><td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 in 40</td></tr><tr><td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 in 200&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit anti Dig antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 in 5,000</td></tr><tr><td>AF647- goat anti Rat IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>AF488-goat anti mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&amp;nbsp;with Axiovision software</td></tr><tr><td>Q-dot 655 filter</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

한 DNA 손상 반응 (DDR)는 광범위 생균 마이크로 레이저 빔 조사에 의해 유도 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)의 연구에있어서되었다. 동독은 interstrand DNA에 크로스 링크 (ICLS)를 포함하여 DNA의 공유 개조를 왜곡하는 나선뿐만 아니라, 정의되지 않는다. 우리는 살아있는 세포의 핵에, immunotagged psoralens의 레이저 photoactivation 현지화 ICLS에 의해 자극 DDR을 공부했다. 부가 배포 및 복제 포크의 만남에 대한 근본적인 문제를 해결하기 위해, 우리는 두 개의 다른 기술과 레이저 현지화를 결합했다. DNA 섬유는 종종 짧은 펄스 중에 혼입 클레오 사이드 유사체의 면역에 의한 복제 포크의 진행을 표시하기 위해 사용된다. Immunoquantum 점은 널리 단일 분자 이미징을 위해 사용되어왔다. 새로운 방식으로, 레이저 국소 ICLS 운반 세포로부터 DNA 섬유 현미경 슬라이드 상에 확산된다. 태그가 달린 ICLS는 immunoquantum 점 및 일 함께 표시됩니다E 간 거리 병변 결정. ICLS와 복제 포크의 충돌이 가시화 될 수 있으며, 다른 만남 패턴 확인 및 정량.

레이저 지역화 파고-TMP (그림 1A) ICLS는 소 랄렌에 연결 발굴 태그에 대한 면역 형광 표시 할 수 있습니다. 레이저 임의 형상의 영역에서 공격 지시 할 수 있지만, 줄무늬 세포 &quot;자연&quot;형상없고, 정당한 신호 용이 의한 일차 또는 이차 항체에 의한 비특이적 결합 아티팩트 구별 될 수있다. 완벽한 특이 이하의 항체를 사용하는 경우이 기능을 사용하면 도움?...

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Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

6.6K 조회수.  National Institute on Aging, National Institutes of Health.  레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다. 

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Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

연구

암 연구학

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

유전학

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

생화학

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of biosensing devices. We report on a protocol of using KrF and ArF lasers irradiating Si (001) samples immersed in a liquid environment with low number of pulses and operating at moderately low pulse fluences to induce Si wettability modification. Wafers immersed for up to 4 hr in a 0.01% H2O2/H2O solution did not show measurable change in their initial contact angle (CA) ~75&#176;. However, the 500-pulse KrF and ArF lasers irradiation of such wafers in a microchamber filled with 0.01% H2O2/H2O solution at 250 and 65 mJ/cm2, respectively, has decreased the CA to near 15&#176;, indicating the formation of a superhydrophilic surface. The formation of OH-terminated Si (001), with no measurable change of the wafer&#8217;s surface morphology, has been confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy and atomic force microscopy measurements. The selective area irradiated samples were then immersed in a biotin-conjugated fluorescein-stained nanospheres solution for 2 hr, resulting in a successful immobilization of the nanospheres in the non-irradiated area. This illustrates the potential of&#160;the method for selective area biofunctionalization and fabrication of advanced Si-based biosensing architectures. We also describe a similar protocol of irradiation of wafers immersed in methanol (CH3OH) using ArF laser operating at pulse fluence of 65 mJ/cm2 and in situ formation of a strongly hydrophobic surface of Si (001) with the CA of 103&#176;. The XPS results indicate ArF laser induced formation of Si&#8211;(OCH3)x compounds responsible for the observed hydrophobicity. However, no such compounds were found by XPS on the Si surface irradiated by KrF laser in methanol, demonstrating the inability of the KrF laser to photodissociate methanol and create -OCH3 radicals.

We report on a process of in situ alteration of HF treated Si (001) surface into a hydrophilic or hydrophobic state by irradiating samples in microfluidic chambers filled with&#160;H2O2/H2O solution (0.01%-0.5%) or methanol solutions using pulsed UV laser of a relative low pulse fluence.

액체 환경에서의 펄스 자외선 레이저 조사에 의한 실리콘 표면의 젖음성의 선택 영역 수정

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

공학

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes in protein structure, protein-protein interactions, or protein-ligand interactions. HRPF utilizes hydroxyl radicals (&#9642;OH) to irreversibly label a protein&#8217;s solvent accessible surface. The inherent complexity, cost, and hazardous nature of performing HRPF have substantially limited broad-based adoption in biopharma. These factors include: 1) the use of complicated, dangerous, and expensive lasers that demand substantial safety precautions; and 2) the irreproducibility of HRPF caused by background scavenging of &#9642;OH that limit comparative studies. This publication provides a protocol for operation of a laser-free HRPF system. This laser-free HRPF system utilizes a high energy, high-pressure plasma light source flash oxidation technology with in-line radical dosimetry. The plasma light source is safer, easier to use, and more efficient in generating hydroxyl radicals than laser-based HRPF systems, and the in-line radical dosimeter increases the reproducibility of studies. Combined, the laser-free HRPF system addresses and surmounts the mentioned shortcomings and limitations of laser-based techniques.

This protocol presents a method to use inline radical dosimetry and a plasma light source to perform flash oxidation protein footprinting. This method replaces the hazardous UV laser to simplify and improve the reproducibility of fast photochemical oxidation of protein studies.

레이저가 없는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국은 단백질의 고주 구조 분석을 수행합니다.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

면역학 및 감염병학

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

생물학

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...