Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

우리가 이러한 프로토콜에 대 한 기준 설정에 대 한 Amayra 에르난데스-베가 필립 알렉산더 Pouille 감사 합니다. 우리는 또한 IBMB-PCB, 자비에 르 스 및 지속적인 지원에 대 한 실험실의 구성원에서 분자 이미징 플랫폼을 감사합니다. 통합 그룹 프로그램 Generalitat 드 Catalunya와 DGI EMB 및 DN에 경제와 스페인의 Competitivity Consolider 보조금의 지원이 작품.

아래 설명 하는 모든 프로토콜 단계 우리 기관의 동물 관리 지침을 따르십시오.
1. 제 브라 문화
<ol><li>번 식 하 고 성인 zebrafish 표준 조건 하에서 유지 합니다. 참고: AB와 TL 야생 타입 배아가이 연구를 위해 사용 되었다.</li>
	<li>배아를 수집 하 고 E3 배아 중간2428.5 ° C에서 그들을 성장. 앞에서 설명한19로 형태에 따라 그들을 무대.</li>
</ol>2. 원자 힘 현미경 검사 법
<ol><li>수동으로 dechorionate zebrafish 태아 (개별 관심에 따라 다른 연령대)의 무대. ( 재료의 표참조) 두 개의 얇고 날카로운 집게와 chorions를 제거 합니다.<ol>
<li>Chorion 한 집게를 사용 하 여 그립 고 눈물에 다른 집게와. 그런 다음, 눈물의 반대 지역에는 chorion를 들고, 개방을 통해 부드럽게 배아 밀어.</li>
		<li>8 X 50 X 사이 확대의 조정 가능한 범위 해 stereomicroscope에서 dechorionation를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>AFM에 대 한 배아를 탑재
	<ol>
<li>배아 중간에 2 %agarose 솔루션을 준비 하 고이 35 mm 페 트리 접시를 채우십시오. 공고히 하자. Agarose 침대에서 얇은 집게와 1.5 m m 직경 (태아 크기의 두 배)의 고 약 350 µ m 깊이 (반 태아 크기)의 작은 구멍을 확인 합니다.</li>
		<li>Agarose 계층에서 만든 넘나들며에 배아를 놓고 그들은 0.5% 낮은 솔루션 주위 확산에 의해 장소에서 녹는 agarose 배아 매체에 보장 합니다. 그냥 구멍에 그들을 확보 하 여 배아를 중심으로이 솔루션을 붓는 다.</li>
		<li>전에 낮은 융 점 agarose는 실 온에서 고형화, AFM에 의해 찾는 것에 관심 영역 것입니다 얼굴을 위쪽으로 (그림 1A) 그런 방법으로 배아를 회전 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>AFM에 의해 태아 검사
	<ol>
<li>거꾸로 원자 힘 현미경 20 X 목표를 채용 하는 페 트리 접시에 배아 이미지를 찾아서 ( 재료의 표25참조) 상 온 (23-24 ° C). 참고: 배아는 유지 배아 중간에 몰입 하 고 agarose 침대에 부착 된.</li>
		<li>0.01 N/m. 5 µ m 및 1 Hz의 주파수에 외팔보 진동의 피크-피크 진폭을 설정의 공칭 스프링 상수와 캔틸레버에 연결 된 지름에서 4.5 µ m의 구형 폴리스 티 렌 구슬 채용 casted 배아의 노 른 자 세포 표면 프로브.</li>
		<li>데이터 평균에 대 한 루틴으로 다른 위치에 및 여러 배아에서 테스트할 각 지역에 대 한 데이터를 수집 합니다. 참고: 좋은 시작 포인트는 5 위치에에서 위치한 중간 10 µ m x 10 µ m 사각형의 모서리에 AFM 현미경의 캔틸레버 위치 XY 압 전 액추에이터를 제어 하 여 이다. 영상 및 데이터 수집 태아 당 약 20 분 했다. 배아 노른자위 세포 표면의 다른 지역에 데이터를 기록, 예를 들어, 식물성 극 또는 EVL 셀 여백 (그림 1B 및 1 C), 거의 다른 지구만 수행할 수 있습니다 고유한 표본 다르게 지향을 채용 하 여.</li>
	</ol></li>
	<li>힘을 계산
	<ol>
<li>압 전 액츄에이터 및 사분면 포토 다이오드를 사용 하 여 그것의 편향 (d)에 광학 레버 메서드에서 현미경 제어 소프트웨어와 결합 하는 스트레인 게이지 센서와 AFM 캔틸레버 (z)의 수직 변위를 측정 ( 재료의 표 참조 25)입니다.</li>
		<li>유리 coverslip 맨 영역에서 수집 된 데이터 로부터 얻은 d-z 곡선의 기울기를 사용 하 여 포토 다이오드 신호와 외팔보 편향 (d) 사이의 상관 관계를 보정 하. 참고: 측정 된 수직 변위 외팔보 편향 이며 경사는 광학 레버26의 편향 감도 나타냅니다입니다.</li>
		<li>외팔보 스프링 상수 (k) 열 요동에서 앞에서 설명한27추론.</li>
		<li>샘플 (h)의 들여쓰기로 계산: h = (z-zc) -(d 조-d에서)          (1) 참고: 여기 zc 접점의 위치 이며 d에서 광다이오드의 오프셋입니다.</li>
		<li>로 캔틸레버에 힘 (F)을 계산: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>점성 액체를 포함 하는 대뇌 피 질의 긴장 Tc 의 탄성 층의 구성 된 액체 풍선 모델 피 긴장을 계산 합니다. 이 모델에서 (태아의 크기에)에 비해 작은 들여쓰기에 힘 증가 비례로4,28 : F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3) 참고: 여기는 구슬의 반지름 Rb Re 이며 태아의 반지름. Zebrafish 태아, 태아 (400 µ m)의 반지름은 두 배나 구슬 (2.25 µ m)의 그것 보다 더 큰으로이 방정식을 접근 수 있습니다. F = 4π Tc h (4)<ol>
<li>계산 하는 긴장 힘-들여쓰기 (F-h) 다섯 가지에 대 한 각 배아 노른자위 셀 영역에 곡선 측정 지점.</li>
		<li>각 F-h 커브 피팅 비 선형 최소 제곱법에 의해 Tc 를 계산 합니다. 위한 통계 분석, 대뇌 피 질의 긴장 Tc 계산 다른 F-h 곡선에서에서 평균 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>낮은 진폭을 적용 하 여 피 질의 점 탄성 특성 (유동성)을 측정 (100 nm) AFM 동안 여 진동25다른 주파수 정현파 파도의 구성.
	<ol>
<li>로 강제 들여쓰기 곡선에서 주파수 영역에서 효과적인 복잡 한 계수 g*(ƒ) 계산: g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5) 여기 내가 허수 단위 이며 F(f)와 h(f)는 힘과 들여쓰기의 주파수 (f) 스펙트럼. b 는 표면에 적용 하는 진동에서 추출 하는 캔틸레버에 점성 드래그에 대 한 보정 이다.</li>
		<li>별도 g*(ƒ) 으로 실수와 허수 부분으로: g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f)          (6) 전각 > g'(f)는 탄성 계수와 탄성 에너지의 측정값 저장 및 진동의 주기 당 복구. g' (f) 방탕된 에너지 차지 점성 계수 이다.</li>
		<li>솔리드 형의 인덱스를 제공 하는 손실 탄젠트를 계산 (< 1) 또는 액체 같은 (> 1), 물자의 행동으로: g' (f) / g' (f)          (7) 참고:이 유형의 측정 수는 매개 변수를 추출 얼마나 점성을 나타내는 이며 어떻게 탄성 시험된 자료. B 는 약간 표면에 캔틸레버의 끝의 거리에 따라, 비록 주어진 g의 매우 낮은 값 ´´는 노 른 자에 의해 전시 ( 2D 그림 아래 참조) 셀, b 에서 작은 변화 영향을 무시할 수 있다 측정29</li>
	</ol></li>
</ol>3. 입자 추적 Microrheology
<ol><li>
노 른 자 셀에 입자 microinjection 수행
	<ol>
<li>맞춤형된 백신 수평 micropipette 끌어당기는 사람 및 모 세관 글라스 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 조작.<ol>
<li>1.00 m m, 0.58 m m 내경 및 끌어당기는 설정을 사용 하 여 10 cm의 길이의 외부 직경 바늘 준비: 압력: 500; 열: 510; 풀: 65; 속도: 25; 시간: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>사용자 정의 만든된 금형 ( 재료의 표참조)를 사용 하는 배아 중간 침대에 똑바로 들여쓰기 레인 1 %agarose 만들어서 주입 페 트리 접시 접시를 준비 합니다.<ol>
<li>금형의 밑면이 고 그들 액체 agarose 젤 위에 놓고 젤 경화는 일단 금형을 제거 합니다. 1.2 X 확대 해 stereomicroscope 아래 agarose에서 금형에 의해 홈에 배아를 플라스틱. 참고: 너비와 금형의 디자인 자체 정렬 배아를 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>주입 하기 전에 거의 완전히 주입 (주입 후 그것을 제거할 때 바늘에 집착 표면 장력 방지 태아/chorion)를 촉진 하기 위하여 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>Microinject 형광 나노 입자 (radius는 = 100 nm, 재료의 표참조) 배아 노른자위 셀 (그림 3A)의 식물에 물 (1:1, 000)에 희석.</li>
		<li>정밀 micromanipulators와 micropipette 조정 하 고 시간과 압력 컨트롤 ( 재료의 표참조)는 자동 microinjector 구슬 주입. 10과 20 psi 사이 압력을 설정 합니다.</li>
		<li>비드 솔루션을 주입 하기 전에 주사를 볼륨 보정 (0.5 nL) 작은 물방울 크기를 측정 하 여 함께 제공 되는 microinjector에 의해 1 x 0.01 m m 단계 마이크로미터 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>주사, 상 온에서 수행 되는 동안 배아를 시각화 해 stereomicroscope에 1.6 X 확대를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
노른자위의 점 탄성 행동 열 요동을 기록 하 여 평가
	<ol>
<li>Dechorionate에서 microinjected 배아 2.1 단계 및 0.5% 낮은 포인트 agarose 배아 중간 솔루션 30 ° c.에 녹는에 그들을 포함 이후에, 유리 하단 번호판 ( 재료의 표참조) 그들을 전송 하 고 오리엔트는 agarose는 여전히 액체 때는 coverslip 쪽으로 그들을 밀어. 참고:는 agarose는 실 온에서 고형화 한다 때 배아 준비가 될 몇 군데입니다.</li>
		<li>Microinjection 후 거꾸로 confocal 현미경 2 h의 무대에 유리 하단 플레이트에 마운트 하는 배아를 놓습니다. 26 나노 입자의 이미지를 캡처 실내 온도 표준 상업 현미경 소프트웨어를 채용 하는 거꾸로 confocal 현미경에 63 X 목표 25 Hz의 샘플링 레이트에서 s (픽셀 크기 = 166 nm, 이미지 캡처 모든 40 ms).</li>
		<li>입자의 중심의 위치를 계산 하 고 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어 (그림 3B)의 TrackMate 플러그인과 함께 시간이 지남에 그들의 궤도 정의 합니다.</li>
		<li>맞춤 소프트웨어6,30 로 각 입자의 2 차원 제곱 변위 (MSD) 계산. < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ)- x(t)]2 + [y(t + τ)- y(t)]2>           (8) 참고: 여기 t 는 경과 시간 및 지연 시간입니다. 순수 점성 액체에는 MSD 스톡-아인슈타인 관계에 따라 점도 (ν)와 반대로 증가: < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) 여기서 T 는 절대 온도입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.

여기 우리가 소재 속성 및 epiboly 동안 zebrafish 노른자위 셀의 일부 biomechanical 매개 변수 수 AFM 및 나노 입자 microrheology에 의해 쉽게 예상할 수 보여줍니다.
AFM 세포와 조직 생리 조건4,5,,2528의 유 변 학적 기능 검색 고용 되었다, 그러나 여기 우리는 AFM 그대로 개발에 적용 하기 위한 ...

전체적 프로세스의 biomechanical 제어 기본 원리는 크게 정의 되지 않습니다. Biomechanical 연구 분자 및 세포 수준에서 상당한 기세, 수집 하는 동안 biomechanical 매개 변수는 조직/유기 체 수준에서의 탐사 초기 단계에 있다. 유체역학 회귀1 또는 비디오 강제로 현미경2 레이저 미세3, 또는 덜 침입적 인 원자 힘 현미경 (AFM) 천연된 셀4 의 능동 및 수동 세력을 구별 하는 연구를 허용 또는 vivo에서 5 또는 나노 microrheology6 조직의 기계적 특성 및 응답의 기대를 수 있습니다.
AFM는 표면 거칠기 및 시험된 표면7접촉 시 캔틸레버 팁의 편향에서 준수 해결 원자 고해상도 3 차원 지형 기술입니다. AFM을 사용 하는 다른 방법론 마찰, 접착 힘, 및 다양 한 재료의 점 탄성 특성 측정을 포함 하 여 표면 특성을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 최근, AFM은 생물 학적 샘플의 기계적 특성에 대 한 정보를 검색 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 특히, AFM 비 접촉 추출할 수 복잡 한 전단 계수 단일 셀에서 알려진된 벤딩 일정8의 캔틸레버에 연결 된 마이크로 팁과 진동 들여쓰기를 적용 하 여. 우리 결과 세력을 유추할 수 있습니다. 그러나, AFM은 고유 하 고 다른 방법론 개별 셀에서 데이터를 유 변 학적 및 기계적 특성을 추출 허용 (예: Micropipette 포부9, 자석 cytometry (MTC)10, 왜곡 또는 단축 인장 테스트11).
그러나, 복잡 한 전체적 프로세스에 이러한 새로운 방법론의 응용 프로그램은 간단 합니다. 미 발달 직물의 기계적 특성을 결정할 때 직면 하는 주요 과제는 작은 m m (µ m), 소프트 (10에2 -104 Pa 범위) 및 소재12의 탄성 (시간에 따른 현상 주는 상승) 자연. 그것은 따라서 배아와 개발 생물의 특정 경우에 기계적 성질 (강성, 점도, 접착)의 결정에 대 한 고용 하는 방법에 적응 하는 것이 중요. 두 가지 중요 한 문제는 고려해 분석 유 변 학적 접근 연구 개발 필요가: 간섭 방해를 방지 하 고 쉽게 액세스를 제공. 이 시나리오에서는 micropipette 포부, MTC와 인장 테스트 한계 전시. 첫 번째 경우, 셀 앓고 높은 변형의 생리 적 및 기계적 특성9변경할 수 있습니다. 두 번째의 경우, 단단히 준수 적용 스트레스 로컬로 골격 변형 되도록 기판에 실험 조직 필요 수 또한 효과 세포의 활성화 상태에서 그리고, 따라서, 그들의 기계적 기능10 소개 . 마지막으로, 단축 인장 접근 유기 체 및 접근성11개발의 형상에 의해 제한 됩니다.
AFM는 어떤 성가신 샘플 준비 없이 그들의 자연 환경에서 직접 수 생물 샘플의 연구 개발 프로세스의 연구에 대 한 더 나은 적합 것으로 보인다. 또한, 미 발달 직물의 분리는 일반적으로 어려운, AFM 프로브의 감소 된 크기 중간 (수성 또는 비 수성), 샘플 온도, 또는 화학 제품의 종류의 선택에서 제한 된 다양성의 높은 학위를 제공 샘플의 구성입니다. AFM는 큰 도메인에 적용 하 여 비늘 시간 충분히 다양 하 고 발달 단계로 또는 생리 적 조건에 조직의 소재 속성을 검색 하 고용 되었습니다. 전체 기본 조직 지형 관점에서 그리고 sclera, 같은 일부 경우에 동맥13 또는 뼈14 연구와 같은 기계적 성질도 검색된15있다. 지 세는 Xenopus16morphogenesis 동안 예를 들어, 셀 재배치의 시각화를 허용 하는 라이브 배아에서 탐구 했다. 마지막으로, 포괄적인 샘플 준비 프로토콜 다른 발달 과정 동안 기계 매개 변수를 확인 하기 위해 개발 되었습니다. 나노 지도 병아리 배아 소화 관11;에 대 한 네이티브 떼어낸된 조직 섹션에 생성 된 접착성 및 기계적 속성 개별 ectoderm, mesoderm, 및 endoderm 조상 셀 gastrulating zebrafish 태아4;에서 격리에 대 한 검색 강성 측정 epiblast 및 조류 배아17; explants에 원시 조 흔에 대 한 수행 그리고 강성 그라디언트 Xenopus5의 배아 뇌에 직접 정의 된의 뚜렷한 패턴.
배아 발달을 탐험에 대 한 AFM을 적용 하기 위한 상당한 질적 도약 접근 하는 간단한 접근 전체적 프로세스에서 올 수 있습니다. 제 브라 epiboly는 다른 조직을 직접 몇 시간에는 blastoderm의 확장을 제한 된 구체의 공간에 조정 하는 필수 및 보존 이벤트입니다. 제 브라 epiboly (구형 단계)의 발병에 표면 층의 세포, 무기력 레이어 (EVL), blastomeres 대규모 노른자위 syncytial 셀에 배아의 동물 극에 중심의 반 둥근 모자를 다루고 있습니다. Epiboly는 EVL의 외피 식물 구 확장 blastoderm, 및 노른자위의 주위 syncytial 노른자위 셀 (E-YSL)의 외부 층의 깊은 세포 (DCs)으로 구성 됩니다. Epiboly는 EVL 및 식물성 극18,,1920에 Dc의 폐쇄와 함께 끝납니다. 어떻게 그리고 어디 힘 epiboly 동안 생성 되 고 아직1,21을 명확 되지 않습니다 어떻게 그들은 세계적으로 결합 하는.
여기 우리가 자세히 AFM zebrafish 노른자위에서 epiboly 진행 하는 동안 수동 기계 조직 속성 vivo에서세포 유추 적용 하는 방법을 설명 합니다. 이렇게 하려면, 우리는 AFM 캔틸레버로 프로브에 연결 하는 작은 스피어 고용. 균일 하지 않은 노 른 자 세포 표면 및 시간이 지남에 정지와 그라디언트 및 그들의 역학을 공부 정확한 지역 정보를 검색할 수 있습니다. 대체 AFM 등 쐐기 캔틸레버22를 사용 하 여 접근, 하지 렌더링 로컬 데이터를 충분히 정확한 것입니다. 캔틸레버 끝에 샘플 크기 보다 큰 쐐기 하기 매우 조심 조작 기술이 필요 합니다, 쐐기 기법은 배아를 검색 하는 데 적합 (~ 2-fold 캔틸레버의 길이 보다 큰) 역학.
모델링 및 질적, 양적 방법으로 셀의 점 탄성 특성 그들의 역학에 대 한 향상 된 이해에 대 한 수 있습니다. Biomechanical 관점에서 epiboly, 그리고 대뇌 피 질의 긴장 측정 및 역학, AFM;에 의해 추출 될 수 있다 수요 지식 뿐 아니라 이해 하는 것이 필수적입니다. 따라서 조직의 생물 속성에 대 한 내용은 필요가 있다. 이 정보를 추출 하 셀 유동성 기법의 다양 한 다른 생리 적인 조건23에서 다른 세포 유형 성격을 나타내기 위하여 수 년에 걸쳐 개발 되었다. 그들은 AFM, MTC, 및 광학 핀셋 (OT)이 포함 됩니다. 그러나 이러한 방법에는,, 입증 되었습니다 배아 또는 장기의 규모에서 생체 분석에 대 한 부적 절 한. 대신, 우리가 성공적으로 나노 추적 microrheology6 유 변 학적 측정 비보에 적응 했습니다. 이 기술은 개별 입자의 브라운 변위를 분석 하 고 로컬 micromechanical 속성을 유추.
함께 AFM와 나노 microrheology epiboly 동안 대뇌 피 질의 정지와 역학의 정 및 노른자위의 내부 기계적 특성을 수 있습니다. 이 정보는 완전히 있는 이방성 스트레스는 EVL의 변형 응답에 있는 다름 결과로 개발 하 고 전자-YSL 피 등방성 actomyosin 수축 노른자위 세포질 레이어 (YCL)은 필수적인 모델 지지 EVL와 epiboly 진행1의 방향 순 이동.

<table><tbody><tr><td>Inverted optical microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td></tr><tr><td>Atomic force microscope (AFM)</td><td>Custom made</td><td>-</td><td>Any commercialized AFM could be employed</td></tr><tr><td>Inverted Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>Casting embryos</td></tr><tr><td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Securing embryos</td></tr><tr><td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-MOLDS</td><td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td></tr><tr><td>Dumont 5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td>1.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; cantilever</td><td>Novascan</td><td>PT.GS</td><td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &amp;micro;m diameter and k=0.01 N/m</td></tr><tr><td>Fluorescent nanoparticles</td><td>Life Technologies</td><td>FluoSpheres F8811,</td><td>For tracking nanorheology</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Borosilicate capillary glass</td><td>Warner Instruments</td><td>G100TF-4</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>Manipulating the micropipette</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>Controlling injection time and pressure</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>Visualization of the embryos during injection</td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td>Analyzing AFM and particle tracking data</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>AB and TL wild type</td><td>-</td><td>Strains employed for embryo collection</td></tr><tr><td>Glass Bottom Plates</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>Measuring injection volume</td></tr></tbody></table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Spatio 시간적 조직 조직 진화의 직접적인 요인 elucidating 연구 개발의 주요 목적 중 하나입니다. 다양 한 제안 다른 발달 및 전체적 프로세스에서 spatiotemporal 조직의 조직과 세포의 기계적 특성의 이해에 중요 한 기여 되었다고 주장 한다. 그러나, 소재 속성 및 비보에긴장 매개 변수 측정을 안정적이 고 접근 가능한 도구의 부족으로이 가설을 검증 어려운 되었습니다. 여기 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 입자 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀의 기계적 특성을 측정 하는 것을 목적으로 추적 하는 방법 제시. Epiboly는 그의 연구는 태아의 투명도 의해 촉진 된 초기 보존된 개발 프로세스입니다. 이 메서드는 구현 하기 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 널리 적용 이후 그들은 조직 역학에 영향을 미칠 수 있는 방해 개입을 극복. 간단한 전략 표본, AFM, 기록과 나노 주사의 장착 및 추적에 대 한 적용 했다. 이 접근에 게 이러한 방법을 쉽게 적응할 수 있는 다른 발달 시간 또는 유기 체.

대뇌 피 질의 긴장 측정 각 측정 지점에 대 한 5 (F-z) 힘-변위 곡선 5 µ m의 피크-피크 진폭 1 Hz에서 캔틸레버 램프에 의해 AFM에 의해 취득 되었다 (속도 = 10 µ m/s)까지 ~ 2 µ m의 최대 들여쓰기. 이 이렇게 20 분 미만 복용 했다 고 했다 epiboly 진행에 의해 영향을 받지 않습니다. 각 실험 조건 적어도 5 배아에서 시험 되었다.
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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

물성 및 비보에 긴장 매개 변수 측정 도구의 부족 방지 개발 하는 동안 그들의 역할을 확인 합니다. 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 나노-추적 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀에 기계적 기능 척도를 고용. 이 메서드는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 관입 개입을 피하.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

afm-and-microrheology-in-the-zebrafish-embryo-yolk-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K 조회수.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas. 물성 및 비보에 긴장 매개 변수 측정 도구의 부족 방지 개발 하는 동안 그들의 역할을 확인 합니다. 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 나노-추적 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀에 기계적 기능 척도를 고용. 이 메서드는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 관입 개입을 피하.

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

생물학

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

신경과학

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 배아를 위한 개선된 Multiview Light Sheet Microscopy 프로토콜

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 고해상도 멀티뷰 광시트 현미경을 위한 제브라피시 배아 장착 전략 — 이미징 및 이미지 재구성 기법

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

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Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

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