Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

Ringraziamo Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille per partecipare alla configurazione di base per questi protocolli. Ringraziamo anche la piattaforma di Imaging molecolare dalla IBMB-PCB, Xavier Esteban e membri del laboratorio per il continuo supporto. Il programma di gruppi consolidati della Generalitat de Catalunya e DGI e Consolider sovvenzioni dal Ministero dell'economia e competitività della Spagna all'EMB e DN supportato questo lavoro.

Tutti i passaggi di protocollo descritti di seguito seguono le indicazioni di cura degli animali delle nostre istituzioni.
1. Zebrafish cultura
<ol><li>Allevare e mantenere zebrafish adulto in condizioni standard. Nota: AB e TL embrioni di tipo selvaggio sono stati utilizzati per questo studio.</li>
	<li>Raccogliere gli embrioni e farli crescere a 28,5 ° C in E3 embrione medio24. Loro fase secondo morfologia come descritto in precedenza19.</li>
</ol>2. atomic Force Microscopy
<ol><li>Manuale dechorionate in scena gli embrioni di zebrafish (di età diverse secondo interessi individuali). Rimuovere chorions con due pinze sottili e taglienti (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Il corion utilizzando una pinza di presa e fare uno strappo in essa con le altre pinze. Poi, tenendo il corion in una regione opposta a quella dello strappo, spingere l'embrione delicatamente attraverso l'apertura.</li>
		<li>Eseguire il dechorionation sotto un dissezione stereomicroscopio con un range impostabile di ingrandimento tra 8 X e 50 X.</li>
	</ol></li>
	<li>Montare gli embrioni per AFM
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di agarosio al 2% nel mezzo di embrione e riempire una scatola di Petri 35mm con questo. Lasciare solidificare. Fare piccoli fori di 1.5 mm di diametro (due volte le dimensioni dell'embrione) e profondità di circa 350 µm (metà delle dimensioni dell'embrione) con una pinza sottile nel letto dell'agarosi.</li>
		<li>Posizionare gli embrioni in poke fatta nello strato di agarosio e assicurare che sono in luogo di diffondere intorno a una soluzione di 0,5% basso dell'agarosi nel mezzo di embrione di fusione. Versare questa soluzione intorno solo gli embrioni per fissarle nei fori.</li>
		<li>Prima l'agarosi di basso punto di fusione si solidifica a temperatura ambiente, ruotare gli embrioni in modo tale che la regione di interesse per essere sondati da AFM dovrà affrontare verso l'alto (Figura 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Esaminare gli embrioni di AFM
	<ol>
<li>Individuare e gli embrioni in di Petri che impiegano un obiettivo X 20 in un microscopio a forza atomica invertito dell'immagine (Vedi Tabella materiali25) a temperatura ambiente (23-24 ° C). Nota: Gli embrioni vengono mantenuti attive immerso nel mezzo di embrione e attaccato al letto dell'agarosi.</li>
		<li>Sonda di superficie delle cellule di tuorlo di casted embrioni che impiegano sferiche perle di polistirolo di 4,5 µm di diametro collegato a un cantilever con una costante primavera nominale di 0.01 N/m. impostare l'ampiezza di picco-picco di oscillazione a sbalzo a 5 µm e la sua frequenza di 1 Hz.</li>
		<li>Raccogliere dati per ogni regione per essere testato in diverse posizioni e in vari embrioni, come una routine, per una media di dati. Nota: Un buon punto di partenza è a cinque posizioni situati al centro e gli angoli di un quadrato di µm 10 µm x 10 controllando la posizione a sbalzo con gli azionatori piezo-elettrici XY del microscopio AFM della sonda. Raccolta dati e la formazione immagine ha preso circa 20 minuti per embrione. Registrazione dei dati in diverse regioni della superficie delle cellule di embrione tuorlo, ad es., il palo vegetal o diverse regioni vicino al margine di cellule EVL (Figura 1B e 1C), può essere solo fatto impiegando esemplari distinti orientati in modo diverso.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolare le forze
	<ol>
<li>Misurare lo spostamento verticale del cantilever AFM (z) con sensori estensimetrici accoppiati per azionatori piezo-elettrici e la sua flessione (d) utilizzando un fotodiodo quadrante dal metodo ottico leva con il software di controllo del microscopio (Vedi Tabella materiali 25).</li>
		<li>Utilizzare la pendenza di una curva d-z ottenuta da dati raccolti da una regione nuda del vetrino coprioggetti per calibrare la correlazione tra il segnale di fotodiodo e la deflessione del cantilever (d). Nota: Lo spostamento verticale misurato è uguale la deflessione a sbalzo e la pendenza rappresenta la sensibilità di deflessione della leva ottica26.</li>
		<li>Dedurre che la costante elastica a sbalzo (k) dalle fluttuazioni termiche come precedentemente descritto27.</li>
		<li>Come si calcola il rientro del campione (h): h = (z - zc) -(d - di)          (1) Nota: Qui zc è la posizione del punto di contatto e dfuori è l'offset del fotodiodo.</li>
		<li>Calcolare la forza (F) su cantilever come: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolare la tensione della corteccia in termini di un modello di liquido-palloncino costituito da uno strato elastico di tensione corticale Tc che racchiude un liquido viscoso. In questo modello, per piccole intaccature (in rispetto alla dimensione dell'embrione), la forza aumenta proporzionalmente4,,28 , come: F = 4 π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3) Nota: Qui Rb è il raggio del cordolo e Re è il raggio dell'embrione. Per l'embrione di zebrafish, come il raggio dell'embrione (400 µm) è a due ordini di grandezza maggiori di quella del tallone (2,25 µm), questa equazione può essere approssimata come: F = 4 π Tc h (4)<ol>
<li>Calcolare vigore il tensionamento-rientro (F-h) curve in ogni regione di cella embrione tuorlo per cinque diverse misure puntuali.</li>
		<li>Calcolare la Tc per ogni F-h curva di raccordo minimi quadrati non lineari. Per l'analisi statistica, la tensione corticale Tc calcolata deve essere mediato da diversi F- curveh .</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare le proprietà viscoelastiche (Reologia) della corteccia applicando ampiezza bassa (100 nm) oscillazioni multifrequenza durante AFM è composta da onde sinusoidali di diverse frequenze25.
	<ol>
<li>Calcolare un efficace modulo complesso g*(ƒ) nel dominio della frequenza, le curve di rientro di forza come: g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5) qui i è l'unità immaginaria e F(f) e h(f) sono gli spettri di frequenza (f) di forza e di rientro. b è la correzione per il trascinamento viscoso su cantilever estratte dalle oscillazioni applicate sulla superficie.</li>
		<li>Separato g*(ƒ) in parti reali e immaginarie, come: g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f)          (6) em > g'(f) è il modulo elastico ed è una misura dell'energia elastica memorizzata e recuperata per ciclo di oscillazione. g' (f) è il modulo viscoso che rappresenta l'energia dissipata.</li>
		<li>Calcolare la tangente di perdita, che fornisce un indice di solido-come (< 1) o simil-liquido (> 1) comportamento del materiale, come: g' (f) / g' (f)          (7) Nota: Con questo tipo di misurazione, è possibile estrarre i parametri che indicano come viscoso ed elastico come è il materiale sondato. Anche se leggermente b dipende dalla distanza dell'estremità del cantilever alla superficie, dati i valori molto bassi di g´ ´ esposto dal tuorlo cella (vedere Figura 2D qui sotto), piccole variazioni di b hanno un impatto trascurabile le misure29.</li>
	</ol></li>
</ol>3. particle Tracking Microrheology
<ol><li>
Eseguire microiniezione di particella nella cella tuorlo
	<ol>
<li>Fabbrichi i microaghi su misura utilizzando un estrattore orizzontale micropipetta e capillare in vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Preparare i microaghi che hanno un diametro esterno di 1,00 mm, un diametro interno di 0,58 mm e una lunghezza di 10 cm utilizzando impostazioni di estrattore: pressione: 500; Calore: 510; Pull: 65; Velocità: 25; Tempo: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare una piastra di Petri di iniezione creando corsie di rientro dritto in un 1% di agarosio nel letto medio dell'embrione che impiegano muffe fatte su ordinazione (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Capovolgere gli stampini e metterli sulla superficie del gel di agarosio liquido e rimuovere gli stampi, una volta che il gel si è solidificato. Dispensare gli embrioni nelle scanalature fatta dalla muffa in agarosio sotto un dissezione stereomicroscopio con ingrandimenti 1.2. Nota: La larghezza e la progettazione degli stampi abilitare gli embrioni per self-allineare.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prima dell'iniezione, quasi completamente rimuovere il mezzo per facilitare l'iniezione (la tensione superficiale che l'embrione/corion incolli all'ago durante la rimozione dopo l'iniezione).</li>
		<li>Microinject nanoparticelle fluorescenti (raggio un = 100 nm, Vedi Tabella materiali) diluito in acqua (1:1, 000) nella parte vegetale della cella embrione tuorlo (Figura 3A).</li>
		<li>Regolare la micropipetta con micromanipolatori precisione e iniettare le perline con un microinjector automatico con controlli di tempo e pressione (Vedi Tabella materiali). Impostare la pressione tra 10 e 20 psi.</li>
		<li>Prima di iniettare la soluzione di perlina, calibrare il volume da iniettare (0,5 nL) misurando la dimensione delle gocce consegnato dalla microinjector con un micrometro oggetto 1 x 0,01 mm (Vedi la Tabella materiali).</li>
		<li>Impiegare un ingrandimento di 1.6 X nella dissezione stereomicroscopio per visualizzare gli embrioni durante le iniezioni, che vengono eseguite a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Valutare il comportamento viscoelastico del tuorlo registrando le fluttuazioni termiche
	<ol>
<li>Dechorionate gli embrioni iniettati come nel passaggio 2.1 e incorporarli in un basso di 0,5% fusione punto agarosio in soluzione medio embrione a 30 ° C. In seguito, trasferirli su piastre di fondo di vetro (Vedi Tabella materiali) e orientare e spingerli verso il coprioggetto quando l'agarosio è ancora liquido. Nota: Quando l'agarosio si solidifica a temperatura ambiente, gli embrioni sono pronti per essere imaged.</li>
		<li>Posizionare gli embrioni montati nelle piastre di fondo di vetro sul palco di un microscopio invertito confocale 2h dopo microiniezione. Catturare le immagini delle nanoparticelle per 26 s a una frequenza di campionamento di 25 Hz con un obiettivo X 63 a temperatura ambiente in un microscopio confocale invertito che impiegano il software microscopio commerciale standard (dimensione dei pixel = 166 nm, immagini catturate ogni 40 ms).</li>
		<li>Calcolare la posizione di centroidi le particelle e definire le loro traiettorie nel tempo con il plugin TrackMate dell'open source software ImageJ (Figura 3B).</li>
		<li>Calcolare il dislocamento di Mean Square bidimensionale (MSD) di ogni particella con software su misura6,30 come: < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8) Nota: Qui t è il tempo trascorso e il tempo di ritardo. In un liquido viscoso puro, il MSD aumenta inversamente con viscosità (ν) secondo la relazione di Stokes-Einstein: < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) dove T è la temperatura assoluta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. 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Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Qui indichiamo che le proprietà del materiale e alcuni parametri biomeccanici della cella tuorlo zebrafish durante epiboly possono essere prontamente stimati mediante AFM e nanoparticelle microrheology.
Mentre AFM è stato impiegato per recuperare le caratteristiche reologiche di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche4,5,25,28, qui abbiamo sviluppato un protoc...

I principi fisici alla base del controllo biomeccanico di processi morfogenetici sono in gran parte indefiniti. Mentre studi biomeccanici a livello molecolare e cellulare stanno raccogliendo un considerevole slancio, l'esplorazione dei parametri biomeccanici a livello del tessuto/organismo è a sua infanzia. Idrodinamica regressione1 o Video microscopia di forza2 permettono ai ricercatori di distinguere le forze attive e passive, mentre laser microchirurgia3o la microscopia a forza atomica (AFM) meno intrusiva di cellule dissociate4 o in vivo 5 o nanoparticelle microrheology6 consentire l'anticipazione di un tessuto proprietà meccaniche e le risposte.
AFM è una tecnica topografica tridimensionale con risoluzione atomica ad alta risoluzione di rugosità superficiale e rispetto dalla deflessione di suggerimenti a sbalzo a contatto con una superficie sondati7. Diverse metodologie che impiegano AFM sono stati sviluppati per studiare proprietà di superficie, compresa la misurazione di attrito, le forze di adesione e proprietà viscoelastiche dei materiali diversi. Recentemente, AFM è emerso come un potente strumento per recuperare le informazioni sulle proprietà meccaniche dei campioni biologici. In particolare, AFM non invadente può estrarre il modulo di taglio complesse da singole cellule applicando oscillatori rientranze con un micro suggerimento attaccato a uno sbalzo di noto curvatura costante8. Questo ci permette di dedurre le forze risultanti. Eppure, AFM non è univoco e diverse metodologie consentono di estrarre dati reologici e proprietà meccaniche da singole celle (ad esempio, micropipetta aspirazione9, magnetico torsione cytometry (MTC)10o uniassiale trazione test11).
Ancora, l'applicazione di queste nuove metodologie a complessi processi morfogenetici non è semplice. Le sfide principali affrontate nel determinare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali sono il piccolo (µm a mm), morbido (nel 102 - 104 Pa gamma) e natura visco-elastico (dando luogo a fenomeni dipendenti dal tempo) del materiale12. È pertanto importante adeguare i metodi impiegati per la determinazione delle proprietà meccaniche (rigidezza, viscosità, adesione) per il caso specifico di embrioni e di organismi in via di sviluppo. Due questioni importanti devono essere prese in considerazione quando si analizzano reologici approcci nello studio dello sviluppo: per evitare interferenze invadente e per fornire facile accessibilità. In questo scenario, l'aspirazione micropipetta, MTC e prove di trazione presentano limitazioni. Nel primo caso, all'elevata deformabilità che soffre di una cella potrebbe alterare le proprietà fisiologiche e meccaniche9. Nel secondo caso, la necessità di aderire saldamente al tessuto sperimentale di un substrato per garantire che le sollecitazioni impresse deformano il citoscheletro localmente potrebbe anche introdurre effetti sullo stato di attivazione delle cellule e, quindi, nelle loro caratteristiche meccaniche10 . Approcci di trazione monoassiali, ultimi sono limitati dalla geometria di sviluppare organismi e accessibilità11.
AFM sembra essere più adatto per lo studio dei processi di sviluppo in quanto permette lo studio di campioni biologici direttamente nel loro ambiente naturale senza alcuna preparazione del campione ingombrante. Inoltre, come dissociazione di tessuti embrionali è generalmente difficile, la ridotta dimensione delle sonde AFM fornisce un alto grado di versatilità con nessuna limitazione nella scelta del tipo di media (acquoso o non acquoso), la temperatura del campione o prodotto chimico composizione del campione. AFM è abbastanza versatile per essere applicato a domini di grandi dimensioni e scale del tempo ed è stato impiegato per recuperare le proprietà materiali dei tessuti in condizioni fisiologiche o distinte fasi di sviluppo. Tessuti intero nativi come arterie13 o ossa14 sono state studiate dal punto di vista topografico e in alcuni casi, come la sclera, proprietà meccaniche sono stati anche estratto15. Topografia è stato esplorato anche in streaming in embrioni permettendo la visualizzazione di, per esempio, la riorganizzazione a cellula durante la morfogenesi in Xenopus16. Protocolli della preparazione del campione globale, ultimo sono state sviluppate per determinare i parametri meccanici durante diversi processi di sviluppo. La nanoindentazione mappe sono state generate su sezioni di tessuto nativo non fissati per il pulcino embrionali digerente11; Proprietà adesive e meccaniche estratto per le singole celle di ectoderma, mesoderma ed endoderma progenitrici isolate da gastrulating zebrafish embrioni4; misurazioni di rigidità per l'epiblasto e linea primitiva su espianti da embrioni aviari17; e un modello distinto di gradienti di rigidità sono definiti direttamente nel cervello embrionale di Xenopus5.
Un salto di qualità notevole per l'applicazione di AFM per esplorare lo sviluppo embrionale può venire da avvicinando semplici accessibili processi morfogenetici. Epiboly di zebrafish è un evento essenziale e conservato, in cui diversi tessuti coordinano in uno spazio ristretto sferico per dirigere l'espansione del blastoderm in poche ore. Al momento della comparsa di zebrafish epiboly (fase sferica), uno strato superficiale di cellule, lo strato avvolgente (EVL), copre una calotta semi-sferica di blastomeri centrata sul polo animale dell'embrione che si siede su una cellula sinciziale tuorlo massiccia. Epiboly consiste dell'espansione corticale ward vegetale dell'EVL, cellule profonde (DCs) il blastoderm, e lo strato esterno della cellula sinciziale tuorlo (E-YSL) intorno al tuorlo. Epiboly si conclude con la chiusura dell'EVL e i controller di dominio al palo vegetal18,19,20. Come e dove le forze sono generate durante epiboly e come sono accoppiate a livello globale non è ancora chiaro1,21.
Qui descriviamo in dettaglio come applicare AFM per dedurre proprietà meccanica passiva del tessuto durante la progressione di epiboly in zebrafish tuorlo delle cellule in vivo. A tale scopo, abbiamo impiegato le piccole microsfere attaccate al cantilever AFM come sonde. Questo consente il recupero di informazioni locale precise all'interno della superficie delle cellule di tuorlo non uniforme e di studiare tensionale gradienti e le loro dinamiche nel tempo. Si avvicina a AFM alternativi come quelli che usano Cuneo cantilever22, saranno dati locali non rendering che sono sufficientemente precisi. La tecnica di Cuneo, che richiede le abilità di manipolazione molto attenta ad incollare una fetta più grande della dimensione del campione all'estremità del cantilever, non è adatta per il sondaggio dell'embrione (~ 2 volte più grande rispetto alla lunghezza dello sbalzo) meccanica.
Modellazione e caratterizzare le proprietà viscoelastiche delle cellule in modo qualitativo e quantitativo consente una migliore comprensione dei loro biomeccanica. Da un punto di vista biomeccanico, è essenziale comprendere epiboly e non solo richiesta conoscenza sulle misurazioni di tensione corticale e dinamiche, che possono essere estratti da AFM; così c'è bisogno di informazioni sulle proprietà biofisiche del tessuto. Per estrarre queste informazioni, una varietà di cellula reologia tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni al fine di caratterizzare i diversi tipi di cellule sotto diverse condizioni fisiologiche23. Essi includono AFM, MTC e pinzette ottiche (OT). Questi metodi, tuttavia, sono stati dimostrati inadeguati per mesoscopiche analisi a scala di embrioni o di organi. In alternativa, abbiamo adattato con successo nanoparticle tracking microrheology6 per in vivo misure reologiche. Questa tecnica analizza gli spostamenti browniani delle singole particelle e vengono dedotte le proprietà locali micromeccanici.
Insieme microrheology AFM e nanoparticelle consentono la definizione delle dinamiche tensionale corticale e proprietà meccaniche interne del tuorlo durante epiboly. Queste informazioni approva pienamente un modello in cui anisotropo stress si sviluppa in conseguenza delle differenze nella risposta deformazione dell'EVL e strato citoplasmico tuorlo (YCL) alla contrazione di actomiosina isotropo della corteccia E-YSL è essenziale per il movimento netto direzionale della progressione EVL ed epiboly1.

<table><tbody><tr><td>Inverted optical microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td></tr><tr><td>Atomic force microscope (AFM)</td><td>Custom made</td><td>-</td><td>Any commercialized AFM could be employed</td></tr><tr><td>Inverted Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>Casting embryos</td></tr><tr><td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Securing embryos</td></tr><tr><td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-MOLDS</td><td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td></tr><tr><td>Dumont 5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td>1.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; cantilever</td><td>Novascan</td><td>PT.GS</td><td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &amp;micro;m diameter and k=0.01 N/m</td></tr><tr><td>Fluorescent nanoparticles</td><td>Life Technologies</td><td>FluoSpheres F8811,</td><td>For tracking nanorheology</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Borosilicate capillary glass</td><td>Warner Instruments</td><td>G100TF-4</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>Manipulating the micropipette</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>Controlling injection time and pressure</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>Visualization of the embryos during injection</td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td>Analyzing AFM and particle tracking data</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>AB and TL wild type</td><td>-</td><td>Strains employed for embryo collection</td></tr><tr><td>Glass Bottom Plates</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>Measuring injection volume</td></tr></tbody></table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Chiarire i fattori che dirigono l'organizzazione spazio-temporale dell'evoluzione tessuti è uno degli scopi principali nello studio dello sviluppo. Varie proposte sostengono di essere stati importanti contributi alla comprensione delle proprietà meccaniche delle cellule e dei tessuti nella loro organizzazione spazio-temporale in diversi processi morfogenetici e di sviluppo. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti affidabili e accessibili per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo, convalida di queste ipotesi è stata difficile. Qui presentiamo metodi che impiegano la microscopia a forza atomica (AFM) e particle tracking con l'obiettivo di quantificare le proprietà meccaniche della cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Epiboly è un processo inerente allo sviluppo conservato precoce cui studio è facilitata dalla trasparenza dell'embrione. Questi metodi sono ampiamente applicabili, affidabile e semplice da implementare poiché essi superare gli interventi intrusivi che potrebbero influire sulla meccanica del tessuto. È stata applicata una strategia semplice per il montaggio di campioni, registrazione di AFM e iniezioni di nanoparticelle e il rilevamento. Questo approccio rende questi metodi facilmente adattabile ad altre volte inerente allo sviluppo o organismi.

Misure di tensione corticale Per ogni punto di misura, cinque curve di forza-spostamento (F-z) sono state acquisite da AFM di dilagare il cantilever a 1 Hz con un'ampiezza di picco-picco di 5 µm (velocità = 10 µm/s) fino a un rientro massimo di ~ 2 µm. Questa procedura stava prendendo meno di 20 minuti e non è stata colpita dalla progressione di epiboly. Ogni condizione sperimentale è stato testato in almeno 5 embrioni.
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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

afm-and-microrheology-in-the-zebrafish-embryo-yolk-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Views.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas. La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all&#39;Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neuroscienze

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di microscopia a foglio luminoso multiview perfezionato per embrioni di zebrafish

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Strategie per il montaggio di embrioni di zebrafish per la microscopia a foglio luminoso multivista ad alta risoluzione - Tecniche per l'ima

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all'Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish