이 연구는 캐나다 컨소시엄 Neurodegeneration 에이징 (CCNA)는, 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 캐나다 (ALS 캐나다), ALS 협회와 캐나다 (ASC)의 알 츠 하이 사회에 의해 전체 또는 일부를 지원 했다. 저자 술탄 Darvesh와 해상 뇌 조직 은행에서 FTLD 뇌 조직을 제공 하기 위한 Spatio 시간적 타겟팅 및 증폭 방사선 응답 (STTARR) 프로그램와의 제휴에서 밀라노 Ganguly 앤드류 리드 감사 하 고 싶습니다. 기관 조직 포함 및 서비스, 그리고는 고급 광학 현미경 시설 (AOMF) 현미경 계기를 제공 하기 위한 단면에 대 한 자금. 케빈 해 들 리 원고의 중요 한 검토에 대 한 감사입니다.

참고: 국제 회의에 조화 (ICH), 위원회에 대 한 국제 단체의 의료 과학 (CIOMS)를 포함 하 여 인식된 국제 표준에 따라 제시 하는 작업 수행 그리고 헬싱키 선언 원칙. 인간의 조직의 사용 대학 건강 네트워크 연구 윤리 위원회의 승인을 했다. 인간의 두뇌 샘플 해상 뇌 조직 은행의 일환으로 수집 되었습니다. 수집 시 동의 모든 환자에서 얻은 했다.
 1. photobleaching 장치 및 솔루션의 건설 <ol><li>준비 재고 솔루션.
	<ol><li>8.77 g NaCl의 그리고 트리 스의 6.06 g을 용 해 하 여 재고 Tris 버퍼 식 염 수 (1 x TBS) 솔루션 (150 m m NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) x 1의 준비 1 L ddH 2 O의 800 mL에서 기지 고 HCl. 1 L와 오토 클레이 브에 볼륨을 가져오기를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정. < / 리 > <li>1 g의 나트륨 아 지 드 (10%, 200 x 재고) ddH 2 O 10 mL에 용 해 하 여 10% (200 x 주식) 나트륨 아 지 드를 준비.</li>
	</ol></li> <li>1-3 표준 크기 슬라이드, 슬라이드 챔버로 단일 100 mm x 100 mm 투명 하 고, 광장 페 트리 접시를 사용. 단일 슬라이드 챔버에 대 한 0.05% 아 지 드-TBS 솔루션 1 x TBS의 50 mL를 200 x 나트륨 아 지 드 재고의 0.25 mL를 추가 합니다. 2-3 슬라이드 챔버 추가 슬라이드를 처리 하는 데 세로로 스택. 아 지 드 TBS 솔루션의 추가 50 mL 각 챔버에 대 한 준비.</li>
	<li>그런 램프 머리 아래 들어갈 수 있는 슬라이드 chamber(s) 상승 발판을 만듭니다.
	<ol><li>는 100 x 100 mm 슬라이드 챔버, 하단에는 100 x 100 mm x 30 mm 플라스틱 음식 컨테이너의 측면 구멍 고 컨테이너 반전. 측면 구멍 하는 LED 광원에 맞게 하단 오프닝 충분히 큰 광원에서 빛 장애 없이 샘플 챔버에 도달 되도록 충분히 큰 확인 하십시오.</li>
		<li>비 계 발판 및 샘플 챔버/벤치탑 사이 그립을 증가 전기 테이프를 적용 됩니다. 어떤 대체 물질을 사용 하 여 너무 오랫동안 안전 하 게 샘플을 도달에서 빛을 방해 하지 않고 슬라이드 챔버를 끌어올리고 발판을 생성.</li>
	</ol></li> <li>직접 도달 하는 샘플 (가능한 경우)에서 LED 빛을 방해 수 있는 LED 어레이 위쪽으로 방향을 책상 램프 디퓨저 또는 불투명 플라스틱을 제거. 비 계 및 슬라이드 chamber(s) LED 어레이 위에 놓습니다. 유연한 목 램프를 사용 하 여 쉬운 조작을 위한.</li>
	<li>구문 반사 돔 줄 상자 슬라이드 챔버와 비 계 알루미늄 호 일 수의 내부 장치에 대 한 커버. 사용 하 여 1 mL 피 펫 팁 상자 단일 챔버에는 150 x 150 mm x 150 mm 골 판지 상자, 다중에 대 한 수직으로 쌓아 챔버.</li>
</ol> 2. Photobleaching 조직 단면도의 전처리 참고: 조직 섹션 준비 조직 및 고정 방법을 사용을 포함의 소스에 따라 다를 수 있습니다. 여기, FTLD T의 경우에서 뇌 조직 (orbitofrontal gyri) ~ 2 일 말린, 자당 그라디언트를 통해 실행, 10 월에 고는 cryostat를 사용 하 여 10 µ m 두꺼운 섹션을 잘라 고정.
<ol><li>는 4 º C 찬 방, 찬 장, 또는 냉장고, 발판 아래 램프 방향을 지정 하 고 발판에 샘플 챔버를 놓습니다. 시료 챔버에 아 지 드 TBS 솔루션 50 mL를 붓고.</li>
	<li>Submerge 조직 섹션 표준 유리 현미경 슬라이드를 포함 하는 아 지 드-TBS 청소 집게를 사용 하 여 슬라이드 챔버에 장착. 여러 슬라이드, 슬라이드는 단일 레이어에 챔버에 배치 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>반사 돔과 기구를 커버, LED 램프 켜고 4 º C에서 48 h에 대 한 품 어.</li>
</ol> 3. 면역 형광 검사 <ol><li>얼룩 phosphorylated 타우 DAPI counterstain와 알 렉 사 488-및 텍사스 레드 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여에 대 한 조직, 먼저 항 원 검색, permeabilization, 차단, 그리고 기본에 대 한 솔루션을 준비 하 항 체 바인딩입니다.
	<li>항 원 복구의 준비 500 mL <ol>버퍼 (10 m m 구 연산, 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산, 0.05% 트윈 20, pH 6.2) 0.92 g의 연산 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) ddH 2 O. 조정 산도의 500 ml의 0.37 g을 용 해 하 여 NaOH와 6.2를 트윈 20의 0.25 mL을 추가.</li>
		<li>0.025%의 500 mL를 준비 Triton X-100 Triton X-100의 0.125 mL 500 mL 1 추가 하 여 TBS 솔루션 (TBS-트리톤)에 tbs. x</li>
		<li>준비에 TBS (BSA TBS 버퍼) 0.1 g 10 ml tbs. BSA를 용 해 하 여 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션</li>
		<li>차단 솔루션을 준비 하는 1%의 1.8 mL를 정상 염소 혈 청의 0.2 mL를 추가 하 여 BSA/tbs.</li>
		<li>각 슬라이드에 대 한 안티-인-PHF-타우 pSer202 + Thr205의 pipetting 1.5 µ L에 의해 1 차적인 항 체 솔루션 (1: 100 희석)의 150 µ L 준비 1% BSA TBS 버퍼 및 얼음에의 148.5 µ L에 항 체 (AT8)</li>
	</ol></li> <li>항 원 복구를 수행 하려면 antigen 검색 버퍼의 25 mL를 포함 하는 슬라이드 수집기에 세로로 photobleached 슬라이드 잠수함. 컬렉터 물 목욕으로 빠지지 않는 그런 테이프 또는 문자열 수집기를 보호 합니다. 30 분 동안 90 ° C에 물 목욕에서 수집기가 열 하 고 슬라이드를 제거 하기 전에 30 분 동안 실내 온도에 냉각 수집기를 허용. 그것으로 즉시 슬라이드 섹션을 밖으로 건조 하면 제거 하지 마십시오.</li>
	<li>는 TBS 트리톤의 30 mL 가득 얼룩 항아리에 항 원 검색 수집기에서 슬라이드를 전송 하 고 부드러운 떨고와 궤도 통에 5 분에 대 한 섹션을 씻어. 신선한 TBS-트리톤으로 한번 세척을 반복 합니다. 윅 보풀 조직과 개요 소수 성 펜으로 조직으로 멀리 초과 버퍼입니다. 알아서 하지 슬라이드 밖으로 건조 하 게.
	<ol><li>각 슬라이드에 대 한 조직 pipetting 200 µ L 조직에 솔루션을 차단에 의해 차단 및 습도 챔버에 슬라이드를 배치. 젖은 종이 수건을 포함 하는 피 펫 팁 상자 안에 슬라이드 랙 배치 하 여 챔버를 구성 합니다. 2 h 평면에 대 한 실 온에서 품 어. 차단 솔루션 완전히 조직을 포함 하는 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>포부에 의해 차단 솔루션을 제거 하 고 조직에 1 차적인 항 체 솔루션의 100-150 µ L 플라스틱. 충분 한 양의 항 체는 1 개의 측에 항 체 솔루션의 풀링 하지 않으려면 레벨 표면에는 구역 확인 합니다. 습도 챔버에 하룻밤 4 º C에서 품 어.</li>
	<li>이차 항 체 혼합물과 DAPI 핵 counterstain 준비.
	<ol><li>각 슬라이드에 대 한 염소 반대로 마우스 알 렉 사 488의 1.5 µ L과 염소 반대로 마우스 BSA TBS의 147 µ L 텍사스 레드의 1.5 µ L을 추가 하 여 이차 항 체 혼합물 (1: 100 희석)의 150 µ L를 준비 하 고 얼음에</li>
		<li>준비 0.1 µ g/mL DAPI 직렬 희석에 의해 counterstain. 재고 솔루션을 철저 하 게 혼합 하 고 재고 5 mg/mL DAPI에서 5 µ g/mL 해결책의 1 mL를 만들려고 TBS의 999의 1 µ L를 희석. 각 슬라이드에 대 한 희석 3 μ0.1 µ g/mL의 최종 농도에 TBS의 147 µ L 5 µ g/mL 해결책의 L. 
		주의: DAPI 알려진된 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 합니다.</li>
	</ol></li> <li>포부에 의해 1 차적인 항 체를 제거. TBS-트라이 톤의 궤도 셰이 커에 부드러운 혼합으로 5 분 동안 세척 30 mL를 포함 하는 항아리를 얼룩 유리에서 슬라이드 잠수함 신선한 TBS-트리톤와 세척 단계를 반복 합니다. 멀리 초과 TBS 트리톤 심지 하 고 각 슬라이드에 이차 항 체 혼합물의 100 ~ 150 µ L 플라스틱.
	<ol><li>확인 조직 항 체 혼합물에 의해 완전히 덮여 있다. 어둠의 습도 챔버에 실 온에서 2 h에 품 어.</li>
	</ol></li> <li>포부에 의해 이차 항 체 혼합물을 제거 하 고 슬라이드 유리 얼룩 TBS (트리톤) 30 mL를 포함 하는 항아리로 전송. 궤도 셰이 커에 부드러운 혼합으로 5 분 동안 세척. 신선한 tbs.와 세척 단계 각 슬라이드에 0.1 µ g/mL DAPI counterstain의 100 ~ 150 µ L을 적용 하 고 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 품 어 반복.</li>
	<li>는 TBS를 포함 하는 항아리를 얼룩 유리 슬라이드를 전송 하 고 5 분 각, 각 세척에 대 한 신선한 TBS를 사용 하 여 부드러운 혼합과 3 번을 씻어. 멀리 초과 버퍼 윅.</li>
	<li>적용 3 방울 수성 장착 매체 조직에의. 집게를 사용 하 여 부드럽게 한 가장자리부터 시작 하 고 천천히 기포의 트랩을 피하기 위해 다른 가장자리를 낮추는 조직에 깨끗 한 유리 coverslip 낮은. 알아서 하지 즉시 이미징 하는 경우는 coverslip를 꺼내. 그렇지 않으면, 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 하기 전에 건조 장착 매체 허용.</li>
</ol> 4. 형광 현미경 검사 법 <ol>형광 램프, 현미경 및 컴퓨터에 <li>차례 15 분 장소 얼룩진된 조직 형광 현미경 단계에서 슬라이드에 대 한 따뜻한 램프를 허용 하 고. 밝은 필드 이미지를 사용 하 여 10 배 확대에 조직 찾습니다.</li>
	<li>DdH 2 O의 드롭 coverslip 표면에 적용 하 고 20 x 물 침수 대물 렌즈를 사용 하 여 (나 = 1.0). 4 라인 평균 비행기 검사 설정을 선택 합니다. 1 공기 단위 ~ 3 미크론의 광학 분할을 주는 작은 구멍 크기를 설정 합니다. 최상의 신호에 대 한 별도 트랙에 각 fluorophore의 레이저 여기 및 방출 파장을 선택 합니다. 
	참고: 알 렉 사 488: ex λ = 488 nm (아르곤 레이저) λ em = 493-570 nm; 텍사스 레드: λ 전 561 = nm (DPSS 561 nm 레이저), λ em 601-635 nm; = DAPI: λ 전 = 405 nm (레이저 다이오드 405), λ em 410-507 nm =.
	<ol><li>레이저 파워를 조정 하 고 각 트랙에 대 한 신호 강도 최적화 하는 설정을 얻을. 합성 이미지를 수집 하 고 저장 합니다. 동일한 레이저 설정을 사용 하 여 다른 슬라이드에 형광 강렬을 비교.</li>
	</ol></li> <li>각 채널에서 형광 강도의 시각화, ImageJ 10 RGB 프로 파일 도구 매크로 설치. 웹 페이지에서 텍스트 파일 (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)으로 매크로 저장 합니다. ImageJ 메뉴에서 플러그인-선택 &#62; 매크로-&#62; 설치; RGB 프로 파일 도구를 설치 하는 텍스트 파일을 선택 합니다.
	<ol><li>Confocal 이미지 파일 ImageJ 열고 다음을 수행 하 여 rgb 3 스택에서 복합 이미지 변환: 이미지-&#62; 색상-&#62; 채널 도구. 선택 &#34; 복합 &#34; 3 채널 드롭다운 메뉴 및 확인 모든. 그런 다음 이미지-선택 &#62; 타입-&#62; RGB 색상.</li>
		<li>는 RGB 프로 파일 도구 아이콘을 선택 하 고 이미지를 프로 파일링 섹션에서 선을 그립니다. 강도 데이터를 스프레드시트로 저장.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

조직의이 원고에 설명 된 photobleaching 전처리 상용 구성 요소를 사용 하 여 autofluorescence의 효과적인 제거 할 수 있습니다. 프로토콜 phosphorylated 타우 포 르 말린 고정 뇌 조직 알 렉 사 488, 핵 counterstain로 DAPI와 텍사스 적색 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 집계의 면역 형광 영상을 설명 합니다. 다른 조직에 메서드를 적용 하려면 시작 지점으로 샘플을 48 h photobleaching 사전 치료를 수행 하는 것이 좋?...

형광 현미경 검사 법 특정 단백질을 표적으로 하는 항 체를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양과 조직에 관심사의 단백질을 시각화 하는 데 사용 됩니다. 면역 형광 검사에서 명확 하 고 확실 한 이미지의 인수를 주요 합병증이 발생할 수 있습니다 endogenously 포유류 조직에서 나이 안료 lipofuscin과 단백질 엘라 스 틴과 콜라겐1, autofluorescence 2. Autofluorescence의 다른 소스는 알데하이드 고정3샘플 준비 단계를 통해 소개 될 수 있습니다. Lipofuscin과 립, oxidatively 수정 단백질과 지질 저하 잔류물의 주로 구성 된 긴 살아있는 세포 증가 나이2에 누적 됩니다. 그러면 뇌와 심장이 나 골격 근육, postmitotic 조직 이미징에 어려움 lipofuscin의 형광 방출 스펙트럼은 광범위 하 고 가변, 자주 사용 하는 일반적인 fluorophores의 방출 파장와 동시 4라벨. 이러한 요인 특히 도전 frontotemporal lobar 변성 (FTLD) 늦은 발병 신경 퇴행 성 질병의 경우에서 인간 뇌 조직의 이미지를 확인 합니다.
Autofluorescence를 줄이기 위해, 우리는 우리와 백색 발광 다이오드 (LED) 배열 가구 책상 램프5를 사용 하 여 슬라이드 마운트 조직 단면도 비추는 기법을 고안 했다. 이 간단한 기술은 대안을 암모늄 아세테이트, 또는 냉각 하는 염료 수단 블랙 B 및 Eriochrome 블랙 T6같은 상용 CuSO4 등 화학 quenchers를 사용 하는 기법을 제공 합니다. 그것은 또한 상당한 비용 절약 이상의 multispectral 있다 램프 photobleaching 기술을 주도하 고 합병증과 스펙트럼 취소 혼합7,8같은 디지털 autofluorescence 제거 방법에서 생성 하는 유물을 피 한다. 백색 발광 Led 있다 넓은 방출 스펙트럼, 높은 광도 및 낮은 제조 비용, photobleaching chromophores5,9다양 한에 대 한 상용 부품으로 이상적.
이 프로토콜에 액세스할 수 있는 구성 요소를 사용 하 여 photobleaching 기구 건설을 설명 하 고 FTLD 조직의 phosphorylated 타우에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 타우-긍정적인 포함 (FTLD-T)를 포함 하는 경우에 photobleaching를 적용. 우리 붙일 표시 된 항 체 두 통용 chromophores 채용 이미징에 photobleaching의 효과 보여줍니다: 알 렉 사 488와 텍사스 레드. 치료 섹션 대 photobleaching의 효과 또는 상업적인 화학 끄는 치료는 계량 하 고 비교. 이 photobleaching 전처리 생물학 견본에서 autofluorescence를 제거 하려면 모든 표준 면역 형광 얼룩 프로토콜에 포함 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T6066</td>
			<td style="width:400px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Choloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>1506656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Azide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SAZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.9923.422</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 W LED Dimmable Desk Lamp</td>
			<td>DBPower</td>
			<td>DS501</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;(EDTA)</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>EDT001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SHY700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water bath</td>
			<td>Haake Fisons</td>
			<td>K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slide collector</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>12-587-17B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Staining Jar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Orbital Shaker</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>&#160;7744-08115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>905.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z672548-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting medium</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28-600-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass soverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td>Software accompanies the Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RGB Profile Tools macro</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Commercial chemical quencher</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy

면역 형광 검사 subcellular 구획을 시각화 하 고 조직 샘플 내 특정 단백질의 지 방화를 결정 하는 데 사용 하는 일반적인 방법입니다. 면역 형광 이미지를 높은 품질의 인수에 큰 방해 lipofuscin 같은 노화 안료 또는 알데하이드 고정 등 일반적인 샘플 준비 과정에 의해 발생 하는 조직의 내 생 autofluorescence입니다. 이 프로토콜 배경 형광을 흰색 형광체 발광 다이오드 (LED) 배열 처리 이전 형광 프로브를 사용 하 여 photobleaching를 통해 크게 줄어들 수 있습니다 방법에 대해 설명 합니다. 흰색 형광체의 넓 스펙트럼 방출 Led 방출 봉우리의 범위에 걸쳐 fluorophores의 표백에 대 한 수 있습니다. Photobleaching 장치 매우 낮은 비용에 상용 구성 요소에서 생성 될 수 있습니다 고 상용 화학 quenchers에 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 뒤에 기존의 면역 형광 염색 직물의 photobleaching 전처리 배경 autofluorescence의 이미지를 생성 합니다. 비교 조사 배경 감소는 화학 quenchers 설립을 신호, photobleaching 처리 했다 프로브 형광 강도에 영향을 주지 않습니다 그것은 배경과 lipofuscin 형광을 효과적으로 감소 하는 동안. Photobleaching 전처리에 대 한 더 많은 시간을 필요로, 하지만 높은 휘도 LED 배열 photobleaching 시간을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 방법은 잠재적으로 다양 한 조직, 두뇌 등 lipofuscin 축적 특히 postmitotic 조직 및 심장 또는 골격 근육에 적용할 수 있습니다.

Photobleaching 전처리 단계 직전 항 원 검색 및 immunostaining (그림 1A) 표준 면역 형광 검사 프로토콜을 추가할 수 있습니다. Photobleaching 장치에의 조립 또한 수행할 수 있습니다, 다양 한을 사용 하 여 저렴 한, 상용 구성 요소 (그림 1B). 흰색 형광체의 발광 스펙트럼 Led 이전 보고서 (그림 1C)5<sup...

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Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

simple-elimination-background-fluorescence-formalin-fixed-human-brain

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.1K 조회수.  University of Toronto. 생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.

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Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit the large-scale identification and quantification of the proteins present in complex biological systems.The knowledge gained from a proteomic approach can potentially lead to a better understanding of the pathogenic mechanisms underlying diseases, allowing for the identification of novel diagnostic and prognostic disease markers, and, hopefully, of therapeutic targets. However, the cardiac mitral valve represents a very challenging sample for proteomic analysis because of the low cellularity in proteoglycan and collagen-enriched extracellular matrix. This makes it challenging to extract proteins for a global proteomic analysis. This work describes a protocol that is compatible with subsequent protein analysis, such as quantitative proteomics and immunoblotting. This can allow for the correlation of data concerning protein expression with data on quantitative mRNA expression and non-quantitative immunohistochemical analysis. Indeed, these approaches, when performed together, will lead to a more comprehensive understanding of the molecular mechanisms underlying diseases, from mRNA to post-translational protein modification. Thus, this method can be relevant to researchers interested in the study of cardiac valve physiopathology.

The protein composition of the human mitral valve is still partially unknown, because its analysis is complicated by low cellularity and therefore by low protein biosynthesis. This work provides a protocol to efficiently extract protein for the analysis of the mitral valve proteome.

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

연구

생화학

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. A prerequisite for the method is that highly ordered crystalline specimen need to be grown from the macromolecule to be studied, which then need to be prepared for the diffraction experiment. This preparation procedure typically involves removal of the crystal from the solution, in which it was grown, soaking of the crystal in ligand solution or cryo-protectant solution and then immobilizing the crystal on a mount suitable for the experiment. A serious problem for this procedure is that macromolecular crystals are often mechanically unstable and rather fragile. Consequently, the handling of such fragile crystals can easily become a bottleneck in a structure determination attempt. Any mechanical force applied to such delicate crystals may disturb the regular packing of the molecules and may lead to a loss of diffraction power of the crystals. Here, we present a novel all-in-one sample holder, which has been developed in order to minimize the handling steps of crystals and hence to maximize the success rate of the structure determination experiment. The sample holder supports the setup of crystal drops by replacing the commonly used microscope cover slips. Further, it allows in-place crystal manipulation such as ligand soaking, cryo-protection and complex formation without any opening of the crystallization cavity and without crystal handling. Finally, the sample holder has been designed in order to enable the collection of in situ X-ray diffraction data at both, ambient and cryogenic temperature. By using this sample holder, the chances to damage the crystal on its way from crystallization to diffraction data collection are considerably reduced since direct crystal handling is no longer required.

A novel sample holder for macromolecular X-ray crystallography along with a suitable handling protocol is presented. The system allows crystal growth, crystal soaking and in situ diffraction data collection at both, ambient and cryogenic temperature without the need of any crystal manipulation or mounting.

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic properties are adapted for the particular function they execute in cells. Myosin 5a processively walks on F-actin to transport melanosomes and vesicles in cells. Conversely, nonmuscle myosin 2b operates as a bipolar filament containing approximately 30 molecules. It moves F-actin of opposite polarity toward the center of the filament, where the myosin molecules work asynchronously to bind actin, impart a power stroke, and dissociate before repeating the cycle. Nonmuscle myosin 2b, along with its other nonmuscle myosin 2 isoforms, has roles that include&#160;cell adhesion, cytokinesis, and tension maintenance. The mechanochemistry of myosins can be studied by performing in vitro motility assays using purified proteins. In the gliding actin filament assay, the myosins are bound to a microscope coverslip surface and translocate fluorescently labeled F-actin, which can be tracked. In the single molecule/ensemble motility assay, however, F-actin is bound to a coverslip and the movement of fluorescently labeled myosin molecules on the F-actin is observed. In this report, the purification of recombinant myosin 5a from Sf9 cells using affinity chromatography is outlined. Following this, we outline two fluorescence microscopy-based assays: the gliding actin filament assay and the inverted motility assay. From these assays, parameters such as actin translocation velocities and single molecule run lengths and velocities can be extracted using the image analysis software. These techniques can also be applied to study the movement of single filaments of the nonmuscle myosin 2 isoforms, discussed herein in the context of nonmuscle myosin 2b. This workflow represents a protocol and a set of quantitative tools that can be used to study the single molecule and ensemble dynamics of nonmuscle myosins.

Presented here is a procedure to express and purify myosin 5a followed by a discussion of its characterization, using both ensemble and single molecule in vitro fluorescence microscopy-based assays, and how these methods can be modified for the characterization of nonmuscle myosin 2b.

체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...