이 작품은 베이징 조합 의학 대학 청소년 기금 및 중앙 대학 (보조금 번호 3332015200)에 대 한 근본적인 연구 기금에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관에 따라 실행 했다. 지도 및 승인의는 연구소의 미세 동물 윤리 위원회 (IMAEC)에 베이징 조합 의학 대학 (PUMC) 현재 프로토콜 입증 되 고 수행 되었다.
1입니다. 동물
<ol><li>실험을 시작 하기 전에 12-h 빛 어두운 주기의 아래 케이지, 제어 온도 (24 ± 1 ℃)와 습도 (55 ± 5%), 3 개의 BALB/c 마우스를 유지. 일반 식품 및 물 쥐를 수 있습니다.</li>
	<li>임의로 나눌 쥐 비 당뇨병 제어 그룹 및 당뇨병 그룹. 정확 하 게 각 개별 마우스 무게 고 각 마우스의 몸 질량을 사용 하 여 주입 볼륨을 계산.</li>
	<li>Streptozotocin (STZ) 주입 하기 전에 4 h에 대 한 마우스를 빨리 하 고 실험 주 1에 정상적으로 정기적으로 물을 제공 합니다.</li>
	<li>PH 4.3에서 0.1 M 나트륨 구 연산 염 버퍼를 준비 합니다. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에는 솔루션의 1 mL를 넣고 microcentrifuge 튜브 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일에 포장.</li>
	<li>나트륨 구 연산 염 버퍼 (pH 4.3) 사용 하기 전에 5 mg/mL의 최종 작업 집중에에서 STZ 해산.</li>
	<li>1 mL 주사기 25 G 바늘을 사용 하 여 40 mg/kg의 복용량에 STZ의 당뇨병 그룹 복 주사의 쥐를 제공 합니다. 나트륨 구 연산 염 버퍼 (pH 4.3)의 동일한 양으로 비 당뇨병 컨트롤의 마우스를 주사.</li>
	<li>다시 감 금 소에 쥐를 넣어 하 고 일반 식품 및 10% 자당 물 공급.</li>
	<li>실험적인 일 2-5 (즉, 다음 4 일 연속)에 1.3-1.7 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 STZ 주입 후 10% 자당 물 일반 물으로 교체 합니다.</li>
	<li>빠른 6 h에 대 한 마우스는 하지만 그들에 게 물에 자유 접근을 9 일 후 (실험 하루 14) 그들의 혈액 포도 당 수치를 측정 합니다. 혈액 포도 당 모니터링 시스템을 사용 하 여 혈당을 확인 하는 꼬리 정 맥에서 혈액 샘플을 수집 합니다. 참고: 마우스 혈액 포도 당 수준 > 200 mg/dL로 당뇨병 간주 됩니다.</li>
</ol>2입니다. 악기의 준비
<ol><li>프로브 팁의 광학 표면 및 입자 또는 어떤 먼지 든 지 제거 하는 부드러운, 비-연마 천으로 레이저 도플러 장치의 프로브 커넥터 청소. 악기 (그림 1A)의 포트에 케이블을 꽂습니다.</li>
	<li>플럭스를 실험 주위 (일반적으로 30 분 동안 실내 온도) 열 평형에 표준 함으로써 교정 스탠드를 조립. 유량을 흔들어 부드럽게 10 s 및 하자에 대 한 표준 2 분 동안 휴식.</li>
	<li>교정 자료 가운데 플럭스 표준 컨테이너를 배치 합니다. 최대 높이에 클램프를 조정 하 고 같은 컨테이너 아래쪽으로 가리키도록 클램프에 프로브를 보호. 플럭스 표준 프로브 아래 올바르게 놓였는지 확인 하십시오.</li>
	<li>팁은 제대로 플럭스 표준에 빠져들 때까지 천천히 아래로 프로브를 이동 합니다. 고 레이저 도플러 장치에 "교정"를 눌러 선택한 프로브에 연결 되어 작동 채널을 선택 합니다. "성공적인 교정" 통지 레이저 도플러 장치 화면에 표시 될 때까지 교정 프로그램을 실행 합니다.</li>
	<li>프로브 프로브 홀더를 사용 하 여 보호 합니다. 수동으로 보안을 피하기 위해 운동 조사.</li>
	<li>일정 온도 (24 ± 1 ° C)에서 실험 룸과 습도 (50 ~ 60%)를 유지 합니다.</li>
	<li>외부 빛 유도 된 변화를 피하기 위해 실험을 수행 하기 전에 모든 외부 빛 (형광등 및 스폿 램프) 등을 해제 합니다.</li>
</ol>3입니다. 동물의 준비
<ol><li>압력솥은 수술 장비와 사용 하기 전에 실내 온도에 냉각 하도록 허용.</li>
	<li>쥐에 게 췌 장 섬 microvascular vasomotion 레이저 도플러에 의해 검출 하기 전에 실험 환경에 순응을 10 분.</li>
	<li>3 %pentobarbital 나트륨의 1 mL에 1 mL 주사기를 채우십시오. Anesthetize 쥐 pentobarbital 나트륨 솔루션 (i.p. 75 mg/kg)을 주입.</li>
	<li>건조를 방지 하기 위해 미리 moistened 의료 거 즈와 마우스의 눈을 커버.</li>
	<li>마우스의 식을 완전히 잃는다 고 꼬리에 더 이상 응답 또는 hindfoot pinches 집게와 확인 하십시오. 필요한 경우 pentobarbital 솔루션의 초기 주입 볼륨의 10% 보완 하 여 마 취를 유지 하는 15 분 마다 마 취와 내부 요원 이벤트를 통해 마 취를 모니터링 합니다.</li>
	<li>동물 아래 반 격리 층을 가진 난방 패드를 배치 하 고 동물 부정사 위치에 놓고 레이저 도플러 장치 작업 역에 그것을 전송. 외과 테이프 작업 플랫폼에 마우스를 수정 합니다.</li>
	<li>면봉, betadine 그리고 75% 에탄올으로 마우스의 복 부 피부는 복 부 지역 깨끗 한 면봉을 사용 됩니다.</li>
	<li>2% lidocaine/0.5% bupivacaine (50/50) 혼합물을 피하 주사.  ~ 3 cm를 잘라-거 즈 갯 솜의 중앙에 직경 구멍. 거 즈 스폰지와 복 부 지역 커버.</li>
	<li>집게와 복 부 피부를 들어올리고 메스 또는 피부가 위를 사용 하 여 복 부의 정중 선 따라 초기 수직 절 개 합니다.</li>
	<li>집게와 기본 근육을 잡고 복 부 구멍을 입력을 incise. 어떤 장기를 다치게 하지 않습니다. 가슴 복 부 구멍을 통해 피부와 내부 근육을 접어. 부드럽게 췌 장 몸과 무딘 코 집게의 쌍을 사용 하 여 비장을 노출 합니다.</li>
</ol>4. 데이터 수집 분석
<ol><li>클릭 하 여 레이저 도플러 장치 소프트웨어를 실행 하 여 "파일" → "New" 새로운 측정 파일을 만듭니다. "일반" 탭에서 연결 된 모니터를 구성 하려면 설정 모니터링 기간을 "무료로 실행 합니다." "LDF 모니터" 탭 "다음"을 클릭에 대 한 기본값을 사용 하 여</li>
	<li>"디스플레이 설정 대화 상자."에서 그래프 표시 설정 해당 상자를 선택 하 여 "플럭스, 광, 속도" 채널을 선택 합니다. 다음 매개 변수를 선택: "채널에 대 한 데이터 소스" 및 "레이블, 단위 그리고 색." 다음 클릭 합니다 "."</li>
	<li>"파일 정보 대화 상자"에서 주제 및 측정 (즉, 이름 및 제목 번호, 연산자, 모니터링 시간, 의견, 등)에 대 한 사용자 정보를 입력 하 고 측정 구성 완료 "다음"을 클릭 합니다. 참고: 측정 창 (그림 1B) 소프트웨어에 의해 자동으로 만들어집니다.</li>
	<li>수동으로 췌 전극 진행. 프로브 및 췌 장 조직 사이의 거리가 1 m m 이내 다는 것을 확인 하십시오. 부적 절 한 거리를 인위적으로 증가 또는 감소 혈액 흐름 읽기를 제공합니다.</li>
	<li>Microvascular 혈액 관류 단위 (PU) 데이터를 녹음을 시작 "시작" 도구 모음 아이콘을 클릭 합니다. 모든 실행 1 분 동안 지속적으로 PU 데이터를 수집 합니다. "중지" 측정을 중지 하려면 클릭 합니다. 선택 "파일" → "다른 이름으로 저장" 이름 하 고 완성 된 측정 파일 저장.</li>
	<li>수동으로 첨가제 효과 수축의 지역화 된 피로 피하기 위해 각 실행 후 프로브를 위치 및 휴식. 각 마우스에 대 한 다 지점 (즉, 3 췌 장 조직에서 무작위로 선택한 포인트) microvascular PU 데이터 수확 4.1-4.4 단계 반복 합니다. 기준 컨트롤 아닌 반사 판의 PU 데이터를 측정 합니다.</li>
	<li>복 부 근육 층과 피부 레이어는 봉합 사를 닫습니다. 실험 후 깨끗 한 장에 동물을 놓습니다.</li>
	<li>난방 패드 절반에 복구 케이지를 배치 하 여 동물 따뜻한을 유지. 참고: 주의 온 정, 위생, 액체 및 음식 섭취 및 감염. 수술 후 통증 관리로 2 mg/kg Carprofen 48 h와 마우스를 관리.  마우스는 심한 통증이 나 고통 완화 될 수 없는 상태에 있을 때 pentobarbital 나트륨 i.p. 150 mg/kg을 주입 하 여 안락사를 수행 합니다.</li>
</ol>5. Microvascular Vasomotion의 매개 변수 계산
<ol><li>레이저 도플러 소프트웨어의 "내보내기" 명령을 사용 하 여 시간 및 PU 원시 데이터를 *.xlsx 파일로 내보내고 스프레드시트에서 파일을 엽니다.</li>
	<li>평균 초기 관류 장치 (PUb) 계산 (단계 4.6 참조).</li>
	<li>평균 혈액 관류 (PU는) 측정의 1 분을 다음과 같이 계산: 혈액 관류 (PU는) 평균 = PU-PUb (식 1).</li>
	<li>측정 각 1 분에 대 한 주파수 (사이클/분)을 계산 합니다. 참고: microvascular vasomotion의 주파수는 분당 microvascular vasomotion 웨이브에서 발생 한 봉우리의 수로 정의 됩니다.</li>
	<li>측정 각 1 분 진폭 (ΔPU)을 계산 합니다.<ol>
<li>Microvascular vasomotion의 진폭 (PU최대) 최대 및 최소 (PU분) 간의 차이 계산: 진폭 (ΔPU) = PU최대 -PU분 (식 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>측정 각 1 분에 대 한 상대 속도 (PU)를 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aalkjaer, C., Nilsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotion:+cellular+background+for+the+oscillator+and+for+the+synchronization+of+smooth+muscle+cells.">Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells.</a> Br J Pharmacol. 144 (5), 605-616 (2005).</li><li>Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+dysfunction:+a+potential+pathophysiological+role+in+the+metabolic+syndrome.">Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome.</a> Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).</li><li>Carmines, P. 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S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Laser+Doppler+for+the+Evaluation+of+Pedal+Microcirculatory+Function+in+Diabetic+Neuropathy+Patients.">Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients.</a> Microcirculation. 23 (1), 44-52 (2016).</li><li>Sun, P. 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G., Bouskela, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+and+the+metabolic+syndrome.">Microcirculation and the metabolic syndrome.</a> Microcirculation. 14 (4-5), 403-438 (2007).</li><li>Chawla, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+content,+tone,+integrity,+and+haemodynamics+for+guiding+fluid+therapy:+a+conceptual+approach.">Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach.</a> Br J Anaesth. 113 (5), 748-755 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Microvascular 역 기능 (예: 당뇨병, 급성 췌 장 염, 주변 microvascular 질병, 등)을 포함 하는 경우, 일부 질병 감소 혈액 흐름 이어질. 혈액의 흐름에 변화, 이외 중요 한 지표, microvascular vasomotion 같은 미세 혈관의 기능 상태를 반영 하는 있다. 특정 표시기, microvascular vasomotion, microvascular 침대에 microvascular 톤의 진동으로 일반적으로 정의 됩니다. 현재 프로토콜 모니터링 시스템 microvascular 혈액...

미세 혈관의 기능 상태를 매개로 microvascular vasomotion 납품 및 산소, 영양분, 호르몬의 교환에 대 한 책임 및 대사 제품, 이산화 탄소, 세포 폐기물 등의 제거에 중요 한 1. microvascular vasomotion 또한 혈액 흐름 분포 및 따라서 로컬 microcirculatory 혈압과 염증, 부 종에 많은 질병을 일으킬 수 있는 응답을 영향을 미치는 조직 관류를 조절. 따라서, microvascular vasomotion 장기2,3,4, 조직 및 구성 세포의 생리 기능을 유지 하기 위해 매우 중요 하다. Microvascular vasomotion의 장애는 미세 혈관 관련 질병5의 개발에 중요 한 단계 중 하나를 수 있습니다.
레이저 도플러 관측 및 미세 혈관 연구6의 분야에서 정량화 처음 개발 되었다. 이 기술은 다른 기술 방식 (예: 레이저 반점7, 경 피 성 산소, 등등), 함께 미세 혈관에 혈 류를 평가 하기 위한 황금 표준으로 여겨 왔다. 근거 (즉, 모 세관, arterioles, venules, 등) 로컬 미세의 혈액 관류 장치 레이저 도플러, 장비에 의해 결정 될 수 있다 도플러 이동 원리를 기반으로 합니다. 파장 및 유도 방출 빛의 주파수 변경 microvessels에서 이동 혈액 세포를 발생 하는 빛 입자 또는 그들은 변경 되지 않습니다. 따라서 미세 혈관, 혈액 세포의 속도 수 microvascular 혈액 흐름 방향은 관련 동안 크기 및 도플러 이동 빛의 주파수 분배에 관련 된 중요 한 요소는. 다른 방법을 사용 하 여, 다양 한 조직 microcirculatory 연구는 mesenteries를 포함 하 여 사용 되 고 지 느 러 미, 생쥐의 피부 집계로 챔버 쥐, 햄스터, 그리고 심지어 인간8. 그러나, 현재 프로토콜에서 우리는 기능에 초점을 사용 하 여 계산 되는 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 상태 레이저 도플러 및 수 제 평가 매개 변수 시스템.
췌 장 섬 미세 주로 췌 장 섬 microvessels의 구성 이며, 독특한 특징을 전시. 췌 장 섬 모 세관 네트워크의 exocrine 대응9의 모 세관 네트워크 보다 5 배 높은 밀도 보여 줍니다. 입력된 포도 당 및 인슐린은 목표에 대 한 도관을 제공, 섬 내 피 세포 제공 산소 metabolically 활성 셀 섬에 β 세포. 또한, 증거를 신흥 보여 섬 microvessels; β-세포의 기능에 영향을 미치는에서 뿐만 아니라 인슐린 유전자 발현과 β-세포 생존 조절에 뿐만 아니라 관련 된 β-세포 증식; 홍보 그리고, vasoactive 신생 물질 및 성장 요인10의 수를 생산. 따라서,이 점에서 우리는 추측할 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태 섬 β-세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 및 급성/만성 췌 장 염, 당뇨병 및 다른 질병의 병 인에 관여 췌 장 관련 질병입니다.
췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태의 병 적인 변화를 분석 하는 것은 위에서 언급 한 질병에 췌 장 섬 미세의 기여를 결정 하는 가능한 전략 될 수도 있습니다. 여기 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 결정 하는 접근을 설명 하는 자세한 단계별 절차를 제공 합니다. 일반적인 측정 대표 결과에 표시 됩니다. 마지막으로, 이점 및 방법의 제한 토론, 추가 응용 프로그램 함께 강조 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>MoorVMS-LDF2</td><td>Moor Instruments</td><td>GI80</td><td>PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data</td></tr><tr><td>MoorVMS-PC Software</td><td>Moor Instruments</td><td>GI80-1</td><td>Software of MoorVMS-LDF2</td></tr><tr><td>Calibration stand</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>Calibration tool</td></tr><tr><td>Calibration base</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>Calibration tool</td></tr><tr><td>Calibration flux standard</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>Calibration tool</td></tr><tr><td>One Touch UltraEasy glucometer</td><td>Johnson and Johnson</td><td>#1955685</td><td>Confirm hyperglycemia</td></tr><tr><td>One Touch UltraEasy strips</td><td>Johnson and Johnson</td><td>#1297006</td><td>Confirm hyperglycemia</td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td>Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>Working concentration 3 %</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Inc.</td><td>200121</td><td>Working concentration 75 %</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Amresco</td><td>335</td><td>Working concentration 10 %</td></tr><tr><td>Medical gauze</td><td>China Health Materials Co.</td><td>S-7112</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Blunt-nose forceps</td><td>Shang Hai Surgical Instruments Inc.</td><td>N-551</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Surgical tapes</td><td>3M Company</td><td>3664CU</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Gauze sponge</td><td>Fu Kang Sen Medical Device CO.</td><td>BB5447</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Yu Lin Surgical Instruments Inc.</td><td>175C</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Skin scissor</td><td>Carent</td><td>255-17</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ning Bo Surgical Instruments Inc.</td><td>3325-77</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Syringe and 25-G needle</td><td>MISAWA Inc.</td><td>3731-2011</td><td>Scale: 1 ml</td></tr></tbody></table>

laser doppler: a tool for measuring pancreatic islet microvascular vasomotion in vivo

미세 혈관의 기능 상태, microvascular vasomotion 산소와 영양분의 공급과 이산화탄소와 폐기물의 제거에 대 한 중요 하다. Microvascular vasomotion의 장애는 미세 혈관 관련 질병의 발달에 있는 중요 한 단계를 수 있습니다. 또한, 매우 vascularized 췌 장 섬 내 분 비 기능을 지원 하기 위해 적응입니다. 이 점에서 그것은 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태 췌 장 섬 기능에 영향을 수 있습니다 추론 가능한 보인다. 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태의 병 적인 변화를 분석 기여를 결정 하는 가능한 전략 있을 수 있습니다 그 췌 장 섬 미세 혈관 관련된 질환, 당뇨병 mellitus, 같은 게 췌 장 염, 등. 따라서,이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태를 확인 하 고 설정 매개 변수 (평균 혈액 관류, 진폭, 주파수, 및 상대를 포함 하는 레이저 도플러 혈액 흐름 모니터를 사용 하 여 설명 합니다. 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 속도) microcirculatory 기능 상태의 평가 위해. Streptozotocin 유도 당뇨 마우스 모델에서 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 장애인된 기능 상태를 관찰합니다. 결론적으로, 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 평가 하기 위한이 방법은 췌 장 섬 질병에 관련 된 메커니즘을 계시 할지도 모른다.

Microvascular vasomotion 측정 레이저 도플러 기기 반도체 레이저 다이오드를 장착 사진 그림 1A에 표시 됩니다. 그림 1B사용자 인터페이스 소프트웨어를 제공. 위에서 언급 한 방법을 사용 하 여, 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 hemodynamic 매개 변수는 비 당뇨병 제어 및 당뇨병 쥐에 대 한 발견 했다. 다양 한 기술, 레이저 도플러 flowmetry?...

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Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

췌 장 섬 microvascular vasomotion 섬 혈액 분포를 조절 하 고 섬 β 세포의 생리 기능을 유지 합니다. 이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 의 기능 상태를 확인 하 고 췌 장 섬 미세 췌 장 관련 질병에의 기여를 평가 하는 레이저 도플러 모니터를 사용 하 여 설명 합니다.

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...

laser-doppler-tool-for-measuring-pancreatic-islet-microvascular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

8.2K 조회수.  Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College. 췌 장 섬 microvascular vasomotion 섬 혈액 분포를 조절 하 고 섬 β 세포의 생리 기능을 유지 합니다. 이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 의 기능 상태를 확인 하 고 췌 장 섬 미세 췌 장 관련 질병에의 기여를 평가 하는 레이저 도플러 모니터를 사용 하 여 설명 합니다.

비디오: Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

연구

의학

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate postprandial delivery of nutrients and hormones to insulin-sensitive tissues. We here describe a technique for combining intravital microscopy (IVM) and contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) of the adductor compartment of the mouse hindlimb to simultaneously visualize muscle resistance arteries and perfusion of the microcirculation in vivo. Simultaneously assessing insulin's effect at multiple levels of the vascular tree is important to study relationships between insulin's multiple vasoactive effects and muscle perfusion. Experiments in this study were performed in mice. First, the tail vein cannula is inserted for the infusion of anesthesia, vasoactive compounds and ultrasound contrast agent (lipid-encapsulated microbubbles). Second, a small incision is made in the groin area to expose the arterial tree of the adductor muscle compartment. The ultrasound probe is then positioned at the contralateral upper hindlimb to view the muscles in cross-section. To assess baseline parameters, the arterial diameter is assessed and microbubbles are subsequently infused at a constant rate to estimate muscle blood flow and microvascular blood volume (MBV). When applied before and during a hyperinsulinemic-euglycemic clamp, combined IVM and CEUS allow assessment of insulin-induced changes of arterial diameter, microvascular muscle perfusion and whole-body insulin sensitivity. Moreover, the temporal relationship between responses of the microcirculation and the resistance arteries to insulin can be quantified. It is also possible to follow-up the mice longitudinally in time, making it a valuable tool to study changes in vascular and whole-body insulin sensitivity.

Insulin-induced vasodilation regulates muscle perfusion and increases the microvascular surface area (microvascular recruitment) available for solute exchange between blood and tissue interstitium. Combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography is presented to simultaneously assess insulin&#39;s action at the larger vessels and the microcirculation in vivo.

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

생물학

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

면역학 및 감염병학

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

마우스 힌드림에 있는 레이저 도플러 관류 화상 진찰

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘 조사

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate mechanisms of vascular smooth muscle and endothelial function in the cutaneous circulation. This technique allows for the pharmacological dissection of the pathophysiology of microvascular endothelial dysfunction as indexed by decreased nitric oxide-mediated vasodilation, an indicator of cardiovascular disease development risk. In this technique, a microdialysis probe is placed in the dermal layer of the skin, and a local heating unit with a laser Doppler flowmetry probe is placed over the probe to measure the red blood cell flux. The local skin temperature is clamped or stimulated with direct heat application, and pharmacological agents are perfused through the probe to stimulate or inhibit intracellular signaling pathways in order to induce vasodilation or vasoconstriction or to interrogate mechanisms of interest (co-factors, antioxidants, etc.). The cutaneous vascular conductance is quantified, and mechanisms of endothelial dysfunction in disease states can be delineated.

저자 스포트라이트: 심혈관 질환 위험 집단의 메커니즘을 밝히기 위한 약리해부 접근법 

Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate microvascular function in health and disease. Both dose-response and local heating protocols can be utilized for this technique to explore mechanisms of vasodilation and vasoconstriction in the cutaneous circulation.

피내 미세투석: 인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘을 조사하기 위한 접근 방식

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

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수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Lepr

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

마우스 힌드림에 있는 레이저 도플러 관류 화상 진찰

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

피내 미세투석: 인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘을 조사하기 위한 접근 방식

피내 미세투석: 인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘을 조사하기 위한 접근 방식